분리된 미토콘드리아의 칼슘 보유 능력의 결정

초록

출처: Li, W., et. al. 미토콘드리아 Ca2+ 보유 용량 분석 및 Ca2+ 유발 미토콘드리아 팽창 분석. J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 미토콘드리아가 칼슘을 흡수함에 따라 형광의 실시간 변화를 모니터링하여 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 분석은 미토콘드리아 기능 및 세포사멸 및 신경퇴행성 질환을 포함한 칼슘 관련 과정을 연구하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 미토콘드리아 Ca²⁺ 보유 능력

의 결정

1. KCl 배지(125mM KCl(염화칼륨), 2mM K₂HPO₄(인산이칼륨), 1mM MgCl₂(염화마그네슘), 20mM HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), 5mM 글루타메이트, 5mM 말레이트 및 2μM 로테논을 준비하고, pH 7.4)를 생성하고 Ca²⁺-결합 녹색 형광 염료를 실험 전에 최종 농도 0.5μM에 첨가합니다.
2. 0.5μM Ca²⁺ 결합 녹색 형광 염료를 함유한 KCl 배지에 분리된 미토콘드리아(0.4mg/mL) 1mL를 각 6웰 플레이트 웰로 옮깁니다.
3. 미토콘드리아와 Ca²⁺ 결합 녹색 형광 염료를 1분 동안 주변광으로부터 보호한 실온의 6웰 플레이트에 배양합니다. 자동 투약 설정을 사용하여 20mM CaCl₂(염화칼슘) 용액(20mM CaCl₂, 127mM KCl, 1mM MgCl_2, 20mM HEPES, 5mM 글루타메이트, 5mM 말레이트, pH 7.4)의 4μL 분취량을 각 6웰 플레이트 웰에 추가하여 200nmol Ca²⁺/mg 미토콘드리아 단백질을 도입합니다.
4. 형광 분광계를 사용하여 여기 파장 506nm와 방출 파장 531nm에서 3초 동안 2분마다 형광 변화를 모니터링합니다. 플레이트는 소프트웨어로 제어되는 판독 사이에 600rpm에서 3초 동안 흔들림이 장착되어 있습니다(그림 1).
5. 각 웰에 20mM CaCl₂ 용액의 4μL 분취액을 추가로 추가하고 2분 동안 3초마다 형광 변화를 모니터링합니다. 시간이 지남에 따라 형광이 증가할 때까지 이 단계를 반복합니다.
   참고: 미토콘드리아는 증가된 기록 형광으로 표시된 Ca²⁺가 추가되어 도전을 받습니다. mPTP(미토콘드리아 투과성 전이 공극)가 열리면 시간이 지남에 따라 형광이 증가합니다.
6. mPTP가 Ca²⁺ 보존 용량으로 열릴 때까지 추가된 Ca²⁺의 총 양을 해석합니다.

결과

그림 1: 미토콘드리아 Ca²⁺ 머무름 용량 분석에 대한 소프트웨어 설정.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
칼슘 그린-5N	생명공학과	C-3737	칼슘 결합 녹색 형광 염료
글루타메이트	시그마-알드리치	RES5063G-A7
말라테	시그마-알드리치	46940-U
로테논	시그마-알드리치	R8875
헵스	시그마-알드리치	H3375
염화마그네슘	시그마-알드리치	457
인산이칼륨	시그마-알드리치	V900050
KCl	시그마-알드리치	P9541
염화칼슘	시그마-알드리치	V900266