$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. Micro-Osmotic Pump 주입 시스템의 준비
참고: 0.2μm 필터로 여과된 완충액을 사용하여 펌프, 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액 및 약물(Met-CCL5/RANTES 단백질 용액(aCSF에서 10ng/mL))을 멸균 조건에서 준비하고 장갑을 낀 채 배양 후드 아래에서 모든 절차를 수행합니다. 수술 절차는 다음과 같이 진행됩니다.
- 수술 하루 전에 미세삼투압 펌프를 준비합니다: 키트와 함께 제공된 1mL 주사기 및 둔탁 바늘로 뇌 미세삼투압 펌프에 인공 뇌척수액(aCSF)을 채웁니다. 미세삼투압 펌프를 CSF에 담그고 쉐이커에 올려 넣고 밤새 부드럽게 흔듭니다.
주의 : 펌프는 CSF로 채워져야 하며 펌프 내부의 기포는 피해야 합니다(그림 1A).
- 수술을 시작하기 전에 실험을 위해 재조합 Met-CCL5/RANTES 단백질 용액(10ng/mL, aCSF로 희석)을 준비합니다. 펌프에서 aCSF를 제거하고 초과분이 누출될 때까지 약물 용액을 펌프에 천천히 채웁니다.
참고: 15mL aCSF 또는 Met-CCL5/RANTES 용액은 5-8개의 펌프에 충분합니다.
주의 : 절차를 반복하여 펌프가 내부에 기포 없이 약물로 완전히 채워졌는지 확인하십시오.
- 카테터 튜브를 원하는 길이로 자르고 뇌 주입 키트의 뭉툭한 뇌 주입 바늘에 부착합니다. 주입 키트와 튜브에 약물을 채웁니다.
- 마지막으로 뇌 주입 키트를 조립하여 미세 삼투압 펌프에 부착합니다.
주의 : 튜브나 펌프에 기포가 형성되어서는 안 됩니다(그림 1A).
- 펌프가 마르는 것을 방지하기 위해 멸균된 50mL 튜브에 aCSF에 설정된 전체 삼투압 펌프-뇌 융합 세트를 담그십시오. 삼투압 펌프-뇌 융합 세트는 이제 수술에 사용할 준비가 되었습니다.
참고: 미삼투압 펌프 시스템은 장기 약물 주입에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 안전하고 편리하게 약물을 쥐의 뇌로 전달할 수 있습니다.
2. 뇌내심실수술 – 미삼투압 펌프의 이식
주의: 75% 에탄올로 수술 환경을 살균하고 연구에 참여한 사람들이 멸균 장갑과 깨끗한 실험실 가운을 착용하고 있는지 확인하십시오. 수술 도구/기구는 사용하기 전에 고압멸균 및 건조해야 하며, 이후 마우스 수술 사이에 75% 에탄올로 멸균해야 합니다.
- 마우스의 무게를 측정하고 케타민/자일라진(케타민 50mg/kg, 자일라진 10mg/kg)과 함께 복강내 주사(IP)를 사용하여 마우스의 무게를 측정하고 마취합니다.
주의: 생쥐의 체중이 24g 미만인 경우 삼투압 펌프 이식 수술에 권장되지 않습니다.
- 마우스 헤드를 정위 장치에 장착하고 고정합니다(그림 1B).
- 수술용 가위와 집게를 사용하여 두개골을 덮고 있는 바깥쪽 피부를 잘라냅니다. 요오드를 사용하여 주변 두개골을 청소합니다.
- 삼투압 펌프-뇌 융합 세트 이식을 위해 목 부위 근처에 있는 한 쌍의 뭉툭한 머리 집게를 사용하여 피부의 가장 바깥쪽 층과 피하 피부층을 분리합니다(그림 1C).
- 정위 장치를 사용하여 뇌 지도(그림 1D)를 참조하여 주입 지점을 표시합니다. 이 실험에서 바늘은 3번째 뇌실 영역(브레그마: 측면 0.0mm, 후방 1.3mm, 복부 5.7mm)에 이식되어야 합니다.
- 못 드릴을 사용하여 두개골에 표시된 영역 주위에 구멍을 뚫습니다(그림 1E).
주의 : 쥐의 수막과 혈관이 끊어지지 않도록 주의하여 뇌의 미세 혈관이 파괴되지 않도록 하십시오.
- aCSF(대조군) 또는 약물(Met-CCL5/RANTES 단백질 용액)이 포함된 미삼투압 펌프-뇌 융합 세트를 목 부위 뒤의 피부 아래에 놓고 천공된 구멍에 뇌 주입 바늘을 삽입하여 약물을 마우스 뇌에 주입합니다(그림 1E). 바늘은 수막을 관통하여 심실로 들어갑니다. 표면 둔감화 젤(그림 1F)을 사용하여 두개골에 바늘을 고정하고 접착제가 마를 때까지 1-2분 동안 기다립니다. 다음으로 바늘 상단의 돌출 부분을 잘라냅니다(그림 1G-H).
- 조직 접착제를 사용하여 머리의 수술 상처를 치료합니다. 상처 위에 접착제 50μL를 바르고 피부의 양쪽을 함께 당긴 다음 피부가 밀봉될 때까지 30초 동안 유지합니다(그림 1I).
주의: 수술 후 상처를 닦을 때는 100% 알코올 패드를 사용하고 감염을 예방하기 위해 스트렙토마이신이 함유된 페니실린 100ul을 사용하십시오. 메모: 쥐 피부는 흉터 조직을 형성하고 수술용 접착제를 투여한 후 며칠 안에 치유됩니다. 접착제의 가장 큰 장점은 피부 자극이나 염증을 유발할 수 있는 수술용 바늘을 피할 수 있다는 것입니다.
- 따뜻한 접시(최대 37°C까지 가열)에 보관된 깨끗한 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 마취 효과에서 회복될 때까지 기다립니다.
주의 : 수술 후 생존 가능성을 높이려면 마우스의 체온을 유지하는 것이 중요합니다.
- 일주일의 회복 기간이 지나면 생쥐는 구강 포도당 내성 검사(OGTT) 및 인슐린 내성 검사(ITT)와 같은 추가 실험을 할 준비가 됩니다.
3. 구강 포도당 내성 검사(OGTT)
참고: aCSF 및 MetCCL5/RANTES(10ng/mL, 100μL) 주입 후 7일 후에 경구 포도당 내성 검사를 수행합니다. 충분한 물 공급으로 OGTT 전에 생쥐를 위해 6시간 금식을 유지하십시오. 실험이 수행되는 동일한 작업대에 동물을 두어 절차에 대한 스트레스를 줄이기 위해 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
- 포도당 용액 준비 : 실험을 수행하기 전에 증류 된 H2O 15 mL에 포도당 3.75 g을 용해시켜 포도당 용액을 준비하십시오.
- 실험 절차 중 판독값을 기록하기 위한 시간표를 설정합니다(표 1).
참고: 실험 중에 정확한 기록을 할 수 있도록 각 혈액 검사 사이에 적절한 간격으로 시간표를 설정하는 것이 중요합니다.
- 단식 후 각 마우스의 무게를 측정하고 주입할 적절한 포도당의 양을 계산합니다. 예를 들어, 마우스의 무게가 30g인 경우 투여할 포도당 용액의 양은 300μL여야 합니다.
- 작업대에서 다음 기기를 준비합니다.
- 혈당계 (시작 버튼을 눌러 배터리 상태를 확인하십시오. 테스트 전에 작동하는지 확인하십시오.)
- 포도당 칩
- 인슐린 주사기(0.3mL 인슐린 주사기)
- 면도날
- 타이머
- 벤치가 설치되면 다음과 같이 혈당 수치를 측정하고 기록합니다.깨끗하고 새로운 포도당 칩을 혈당계에 넣고 시작 버튼을 눌러 0으로 설정합니다.
- 마우스 목 뒤를 잡고 꼬리를 몇 번 쓰다듬어 꼬리 부위에 충분한 혈류가 흐르
도록 합니다.
- 새 면도날을 사용하여 꼬리의 작은 조각을 자르고 포도당 칩에 작은 혈액 한 방울(약 10-20μL)을 짜냅니다. 정확한 측정이 가능하도록 혈액이 칩을 채워야 합니다. 혈당계는 포도당 수치를 즉시 표시합니다. 기계에 "오류"가 표시되면 새 포도당 칩으로 절차를 반복하십시오.
알림: 포도당 칩에는 혈액 한 방울만 필요합니다. 혈액 샘플을 두 번 이상 채취해야 하는 경우 손가락으로 마우스의 꼬리를 여러 번 움직여 압력을 가하고 꼬리 끝을 칩 바로 위에 올려 혈액을 채취하면 됩니다. 혈액 샘플을 채취하는 동안 매번 꼬리 끝을 자를 필요는 없습니다.
- 다음으로, 위내 위내 기술을 사용하여 마우스에 포도당(0.25g/mL)을 경구로 공급합니다. 투여할 포도당의 양은 다음 공식을 사용하여 계산해야 합니다: 10X 체중(BW) μL 포도당 용액(예: 마우스의 체중이 30g인 경우 투여할 포도당 용액의 양은 300μL). 경구 포도당을 투여한 직후 타이머를 시작하십시오.
- 15분, 30분, 60분, 90분, 120분에 포도당 측정 절차를 반복합니다.
- 모든 포도당 수치 판독값을 기록한 후 면도날과 포도당 칩을 생물학적 위험 용기에 버리십시오. 먹이를 쥐 우리에 다시 넣고 동물실로 돌려주세요.
표 1. 구강 포도당 내성 검사(OGTT) 기록 시간표
분
분
의
의
개
호
의
분
시
개
호
명
초
초
초
초
초
분
| # | 마우스 ID | 몸 | 포도당 | 시작하다 | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | 무게 | μL = 10xBW | 시간 | 분 | 분 | 분 | 분 | 분 |
| 1 | 501 | 25.8골드 | 258 | 오전 9:00 | 오전 9:00 | 오전 9:00 | 9:15 | 오전 9시 30 | 오전 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3골드 | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10시 7 |
