도파민 뉴런을 표적으로 하기 위한 마우스 뇌 조직 절편의 면역조직화학(Immunohistochemistry of mouse brain tissue sections for targeting dopamine neurons)

초록

출처: Kummari, E., et. al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area., J. vis. exp. (2015)

이 비디오에서는 후속 레이저 캡처 미세해부를 위한 뇌 조직 절편의 도파민 뉴런에 대한 면역조직화학 프로토콜을 시연합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 슬라이드 및 조직 준비

1. 실란 준비 슬라이드 또는 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 멤브레인 유리 슬라이드를 사용합니다.
2. RNA 분리를 위해 RNase 오염 제거 용액에 슬라이드를 담그고 RNase가 없는 물로 3회 세척한 다음 등급이 매겨진 일련의 RNase-free 에탄올로 탈수하고 30분 동안 진공 건조합니다.
3. 저온 유지 장치를 사용하여 10μm 두께로 조직 절편을 절단하고 준비된 RNase 프리 슬라이드에 장착합니다. RNA 품질을 유지하기 위해 절편 중 절편을 동결 상태로 유지하십시오. 참고: LCM은 슬라이드 가장자리에 너무 가까운 조직을 제거할 수 없으므로 조직이 슬라이드 가장자리에서 약 4mm 떨어져 있는지 확인하십시오. PEN 멤브레인 슬라이드에서 조직을 제거하려면 조직이 슬라이드에 부착되지 않은 멤브레인의 치수인 슬라이드의 왼쪽, 상단 및 하단에서 4mm, 오른쪽에서 7mm 떨어져 있는지 확인하십시오.
4. 직접 면역조직화학을 사용하여 개별 세포 집단을 분리하기 위해 실란-프렙 슬라이드 또는 PEN 멤브레인 슬라이드에 조직을 절편화합니다. 간접 면역조직화학 유도 기법을 사용하여 조직 영역을 분리하기 위해 면역조직화학을 위한 실란-준비 슬라이드에 한 세트의 절편을 장착하고 LCM에 사용할 PEN 멤브레인 슬라이드 및/또는 실란-준비 슬라이드에 대체 절편을 장착합니다.

2. 레이저 캡처를 위한 조직 준비 – 면역 반응성 세포의 직접 레이저 캡처를 위한 신속한 티로신 하이드록실라제 면역조직화학

1. 소수성 펜으로 조직의 윤곽을 그리고 건조시킵니다.
2. -20°C에서 10분 동안 아세톤-메탄올(1:1) 용액으로 조직을 고정합니다. 참고: 우리의 경험에 따르면 아세톤-메탄올 고정은 아세톤 또는 메탄올 단독보다 훨씬 더 일관된 면역조직화학을 초래했습니다.
3. 1% Triton(RNase free)이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)에서 슬라이드를 헹굽니다.
4. 100-200 μl PBS로 섹션을 1% Triton과 400 U/ml RNasin으로 1:100 희석된 티로신 하이드록실라제 항체로 덮습니다. 5-10분 동안 배양합니다.
5. PBS에서 두 번 간단히 헹구고 PBS-1% 트리톤으로 헹굽니다.
6. PBS-1% 트리톤에서 1:100으로 희석된 Alexa Fluor 488로 표지된 100-200 μl의 염소 항 토끼 IgG와 400 U/ml RNasin 및 50 ng/ml DAPI로 조직을 덮습니다. 5분 동안 배양합니다.
7. PBS에서 2번 헹군 다음 RNase 프리 에탄올(75%-75%-95%-100%-100%)의 등급별 시리즈로 30초 동안 탈수합니다.
8. 자일렌을 1분, 5분 동안 두 번 세척하여 배양합니다.
9. LCM에 사용하기 직전에 자일렌에서 슬라이드를 제거하고 자연 건조시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실란 준비 슬라이드	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% 에탄올-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% 에탄올-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 염소 anti-rabbit IgG	Life Technologies, 그랜드 아일랜드, 뉴욕	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, 그랜드 아일랜드, NY	AM9780