Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

초록

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022).

이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

프로토콜

1. General considerations

1. 단백질 이동(protein trafficking)에 관한 분석을 위해 영구적으로 횡문에 위치한 전위 단백질을 발현하는 초파리 스톡을 사용하십시오(예: TRPL(Transient receptor potential-like) 이온 채널:: 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP), Arrestin 2( Arr2)::eGFP)를 사용합니다.
2. 실험적 접근을 위해 선택된 파리의 빛 노출 조건을 미리 결정합니다.
   1. 어두운 적응을 위해 25°C에서 원하는 기간 동안 파리를 어두운 상자에 보관하십시오. 전좌 실험에서 최대 16시간의 조명(예: 파리를 발현하는 TRPL::eGFP)의 경우 파리를 실온의 형광등 아래에 보관합니다.
   2. 색광으로 파리를 비추려면 형광등과 함께 다른 색상의 투명 플라스틱 상자를 사용하십시오.

2. 수침 현미경

1. Fly preparation
   1. 그림 1과 같이 필요한 장비와 시약으로 작업 공간을 준비합니다.. 미리 결정된 연령 및 조명 조건의 플라이를 사전 냉각된 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 15-30분 동안 얼음 위에서 배양하여 마취합니다.
      참고: 1일 된 어두운 적응 파리를 참고로 가지고 다니십시오. 일반적으로 어둡게 적응한 파리는 어두운 곳에서 뚜껑이 있는 아이스박스로 옮겨야 합니다. 빛에 적응한 파리는 실내 조명에서 얼음으로 옮길 수 있습니다.
   2. 얼음 마취된 플라이 하나를 200μL 피펫 팁에 머리부터 옮기고 압축 공기로 플라이를 팁 쪽으로 조심스럽게 밀어 넣습니다.
   3. 메스를 사용하여 머리 바로 앞의 피펫 끝을 잘라냅니다. 핀셋을 사용하여 플라이를 끝에서 몇 밀리미터 떨어진 곳으로 조심스럽게 밉니다. 피펫 팁을 다시 잘라내고 압축 공기로 플라이를 팁 쪽으로 다시 밀어 플라이 머리만 피펫 팁에서 돌출되도록 합니다.
   4. 참고: 이미지 획득이 크게 지연되면 파리가 다시 깨어나고 움직여 이미지가 흐려질 수 있습니다.
      
2. Image acquisition
   1. 준비된 플라이가 있는 물체 슬라이드를 현미경 스테이지에 조심스럽게 놓고 침수 대물렌즈를 선택합니다.
   2. 파리의 눈이 물방울에 닿을 때까지 수중 침수 목표를 수동으로 내립니다(그림 3A, B).
   3. 현미경 UV 램프를 켜고 적절한 필터 세트를 선택합니다. 접안렌즈를 사용하여 파리를 대물렌즈 아래에 배치하고 현미경을 눈 표면에 초점을 맞춥니다.
   4. 현미경 카메라 쪽으로 광 경로를 전환하고 해당 소프트웨어에서 라이브 이미지를 생성합니다. 그림 3C-E에 자세히 나와 있는 것처럼 눈이 현미경 대물렌즈를 방사상으로 향해야 한다는 점을 고려하여 카메라의 초점을 재조정하고 눈의 방향을 평가합니다.
   5. 이미징 소프트웨어 내에서 적절한 LUT(조회 테이블)를 사용하여 과채도(빨간색 픽셀로 표시)를 감지합니다.
   6. 색소가 없는 파리의 경우 가장 밝은 픽셀이 모든 이미지의 채도 한계 바로 아래에 있도록 노출 시간을 조정하십시오.
   7. 이미지를 기록하고 원시 파일로 저장하여 기록의 모든 해당 메타데이터를 보관합니다. 다음 수량화에 대해 .tif 형식으로 이미지를 내보냅니다.
      참고: 추가 실험에 사용하려는 경우 이미지 획득 직후 빨간색 조명(예: 630nm)으로 5분 동안 파리를 비춥니다. 적색광은 이미지 획득 중에 강렬한 단파광에 의해 과도하게 활성화된 광변환 캐스케이드를 비활성화합니다.
      
3. Data analysis and quantification of relative eGFP fluorescence in the rhabdomeres of water immersion micrographs
   1. ImageJ/Fiji 소프트웨어를 다운로드, 설치 및 실행합니다.
   2. >Analyze > Set Measurements를 클릭하여 ImageJ 설정을 조정합니다... 을 클릭하고 Mean Gray Value(평균 회색 값) 상자만 선택합니다. File > Open....tif 또는 드래그 앤 드롭으로. 초점이 맞춰진 이미지의 대표 영역을 선택하고 Ctrl과 +를 반복해서 눌러 200%-300%로 확대합니다.
   3. 참고: 원형 선택의 정확한 크기(픽셀 또는 미크론)는 특정 설정에 따라 다릅니다. 1일 된 어둡게 적응된 대조 파리의 횡문근 직경의 약 1/3 또는 1/4 정도의 원을 사용하십시오.
   4. 원형 선택 영역을 마우스 클릭으로 클릭하고 드래그하거나 키보드의 화살표 키를 눌러 이동합니다.
   5. 원형 선택 내에서 형광 강도를 측정하려면 원을 첫 번째 횡문(r1)으로 이동하고 >분석 > 측정을 클릭하거나 단축키 Ctrl + M을 사용합니다. 측정된 회색 값을 나열하는 결과 창이 나타납니다.
   6. R2-R6의 측정을 반복 측정 및 배경 신호(b)의 측정으로 계속합니다. 색소가 없는 파리의 경우 해당 세포체 영역(c1-c6)을 추가로 측정합니다(그림 4).
   7. 두 개의 오마티디아에 대해 2.3.5 및 2.3.6 단계를 반복하여 세 개의 기술 복제가 생성됩니다. 연필 도구를 사용하여 분석된 옴마티디아를 표시하고 문서화를 위해 이 이미지를 저장합니다.
   8. 횡문에 존재하는 eGFP의 상대적인 양을 계산합니다.
   9. 2.3.3단계에서 다음 이미지를 계속합니다. 신뢰할 수 있는 측정을 위해 각 실험 그룹의 최소 5명의 개인으로부터 얻은 이미지를 생물학적 복제물로 사용하는 것이 좋습니다.

결과

그림 1: Water Immersion Microscopy 작업 공간. 필요한 재료는 다음과 같습니다: (A) 15 mL 원심분리 튜브, (B) 얼음 조각, (C) 냉각 증류수, (D) 실체 현미경, (E) 페트리 접시, (F) 플라스틱, (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
이산화탄소 마취 플라이 패드	Flystuff	59-172
차가운 빛 램프 (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
UV 램프, 카메라, 필터 세트 및 소프트웨어가 있는 형광 현미경(AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
형광등	Osram	4050300518039.00
실험실 피펫 (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
피펫 팁 (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
스테레오 현미경 (SMZ445)	Nikon
UV 램프, 카메라, 파일러 세트 및 소프트웨어가 있는 스테레오 현미경(MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica