Neurodegenerative Protein Overexpression을 이용한 효모 세포의 히스톤 변형 검출(Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression)

초록

출처: Bennett, S. A., et al., 효모 신경퇴행성 단백질병증 모델에서 히스톤 번역 후 변형 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 신경퇴행성 단백질을 과발현하는 효모 세포의 히스톤 변형을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 단계에는 세포 용해, 원심분리, 전기영동, 멤브레인 전달 및 변형된 히스톤의 항체 기반 검출이 포함됩니다.

프로토콜

1. 히스톤 번역 후 변형을 감지하기 위한 세포 용해 및 웨스턴 블로팅

1. 세포 용해
   1. 얼음 위에서 효모 세포 펠릿을 해동하고 세포 펠릿을 100μL의 dH₂O.
   2. 세포 재현탁액으로, 300μL의 0.2M NaOH와 20μL의 2-메르캅토에탄올을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 다시 부유시킵니다.
   3. 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양한 다음 상온 원심분리기에서 3,200 x g로 원심분리하여 RT에서 30초 동안 합니다. 상등액을 폐기합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x Running Buffer			: 글리신 141.65g (ThermoFisher BP381-1), 티즈마 염기 30.3g (Sigma-Aldrich T6066), 도데실황산나트륨 10g (Sigma-Aldrich L3771) 및 탈이온수 1L, pH 8.8.
12% 폴리아크릴아미드 겔	BIO-RAD	456-1041
2-메르캅토에탄	Sigma-Aldrich	M3148
안티아세틸-히스톤 H3(Lys14) 기본 항체	MilliporeSigma	07-353 (Lot No. 2762291)	Dilution: 1/1000
anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) primary antibody	Abcam	ab109463 (로트 번호. GR187780)	Dilution: 1/2000
anti-acetyl-histone H4 (Lys12) primary antibody	Abcam	ab46983 (로트 번호. GR71882)	Dilution: 1/5000
anti-dimethyl-histone H3 (Lys36) primary antibody	Abcam	ab9049 (로트 번호. GR266894, GR3236147)	Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody	Abcam	ab24834 (로트 번호. GR236539, GR174196, GR3194335)	핵 장전 제어; 희석: 1/2000
anti-phospho-histone H2B (Thr129) primary 항체	Abcam	ab188292 (Lot No. GR211874)	Dilution: 1/1000
anti-phospho-histone H3 (Ser10) Primary Antibody	Abcam	ab5176 (로트 번호. GR264582, GR192662, GR3217296)	희석: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
원심분리기 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
당나귀 안티 마우스 IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (로트 번호 C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution: 1/5000
donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	희석 : 1 / 2500
에탄	시그마-알드리치	E7023
매우 두꺼운 오점지(여과지)<	1703968
Immobilon-FL 전사 멤브레인	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL 글리세롤, 1.2 mL 0.5M Trizma 염기 pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632) 및 2.1mL 탈이온수.
메탄	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀	BIO-RAD	1658004
멀티채널 피펫	Eppendorf	2231300045
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	A. Gitler의 선물		<
Sigma-Aldrich	P4338	50% w/v 솔루션을 준비합니다.
Ponceau S Stein	Sigma-Aldrich	P3504	혼합: 0.5g 0.1% w/w Ponceau S 염료, 5mL 1% v/v 아세트산(Sigma-Aldrich 320099) 및 500mL 탈이온수.
PowerPac 기본 전원 공급 장치	BIO-RAD	164-5050
도데실황산나트륨 로딩 버퍼			-20 oC에서 보관하십시오. 6X, 믹스: 도데실황산나트륨 1.2g, 브로모페놀 블루 6mg, DL-디티오트레이톨 0.93g, 탈이온수 2.1mL, 글리세롤 4.7mL 및 0.5M 트리즈마 염기 1.2mL, pH 6.8.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	0.2M 용액을 준비합니다.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), 900 mL 탈이온수.
TBS 차단 버퍼	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry 전기영동 전사 셀	BIO-RAD	170-3940
전송 완충액			mix: 글리신 22.5g, 티즈마 염기 4.84g, 메탄올 400mL, 도데실황산나트륨 1g, 탈이온수 1.6L.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, 용액: 트리즈마 염기 24g과 염화나트륨 88g(Sigma-Aldrich S7653)을 혼합합니다. 탈이온수를 1L까지 채웁니다.
WT 303 S. cerevisiae 효모	J. Shorter의 선물

올올td 스타일='너비:108pt;'>BIO-RAD올td 스타일='높이:15.75pt;너비:135pt;'>폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)