Neurodegenerative Protein Overexpression을 이용한 효모 세포의 히스톤 변형 검출(Detecting Histone Modifications in Yeast Cells with Neurodegenerative Protein Overexpression)

초록

출처: Bennett, S. A., et al., 효모 신경퇴행성 단백질병증 모델에서 히스톤 번역 후 변형 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 신경퇴행성 단백질을 과발현하는 효모 세포의 히스톤 변형을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 단계에는 세포 용해, 원심분리, 전기영동, 멤브레인 전달 및 변형된 히스톤의 항체 기반 검출이 포함됩니다.

프로토콜

1. 히스톤 번역 후 변형을 감지하기 위한 세포 용해 및 웨스턴 블로팅

1. 세포 용해
   1. 얼음 위에서 효모 세포 펠릿을 해동하고 세포 펠릿을 100μL의 dH₂O.
   2. 세포 재현탁액으로, 300μL의 0.2M NaOH와 20μL의 2-메르캅토에탄올을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 다시 부유시킵니다.
   3. 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양한 다음 상온 원심분리기에서 3,200 x g로 원심분리하여 RT에서 30초 동안 합니다. 상등액을 폐기합니다.
   4. 세포 펠릿을 100μL의 1x loading 염료에 재현탁시키고 가열 블록에서 10분 동안 끓입니다.
      참고: 6배 로딩 염료의 제조법은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
2. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 멤브레인 이동
   1. 겔 홀더에 두 개의 겔을 배치하고, 내부 챔버를 러닝 버퍼로 맨 위로 채우고, 외부 챔버를 2-겔 라인 표시까지 채워 겔 챔버를 준비합니다.
   2. 웰당 15μL의 샘플을 10웰 12% 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다. 단백질 ladder lane의 경우 5 μL를 로드합니다.
   3. 150 V에서 약 45분 동안 또는 로딩 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 겔을 실행합니다.
   4. 겔이 작동하는 동안 섬유 패드(겔당 2개)를 전달 버퍼(Table of Materials)에 담그고 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 메탄올에 담궈 멤브레인 이동을 준비합니다. 옮기기 전에 전달 버퍼에서 멤브레인을 헹굽니다.
      참고: PVDF 멤브레인은 겔 크기로 절단해야 하며 전달되는 모든 겔에 대해 하나의 PVDF 멤브레인을 사용해야 합니다. 위치
   5. 반건조 전사 장치 셀에 전사 '샌드위치'를 조립합니다: 하단 전극에서 (1) 미리 담근 섬유 패드, (2) 미리 담그고 헹궈낸 PVDF 멤브레인, (3) 겔 및 (4) 두 번째 미리 담근 섬유 패드를 놓습니다.
      참고: 전사 '샌드위치'에 기포가 생기지 않도록 '샌드위치'를 혈청학적 피펫으로 부드럽게 굴려 기포를 밀어냅니다. 겔을 PDVF 멤브레인 위에 놓은 후에는 움직이지 마십시오.
   6. 단백질 전달을 수행하려면 파워 팩을 150시간 동안 1mA로 설정하십시오('샌드위치' 1개).
3. 변형 특이적 항체를 사용한 히스톤 번역 후 변형(PTM) 검출
   1. 전달 장치에서 멤브레인을 제거합니다. dH₂O.
      1. 선택적으로 작은 플라스틱 상자에 멤브레인을 덮을 만큼 충분한 Ponceau-S 염색을 붓고 RT에서 30-60초 동안 부드럽게 흔들어 배양하여 Ponceau-S 염색으로 단백질의 전달을 확인합니다. Ponceau-S 얼룩을 제거하고 배경 얼룩이 사라지고 단백질 띠가 육안으로 보일 때까지 dH₂O로 헹굽니다. 멤브레인에서 모든 얼룩이 제거될 때까지 dH₂O로 계속 헹굽니다.
   2. 작은 염색 상자에 트리스 완충 식염수(TBS) 차단 완충액(Table of Materials)을 부드럽게 흔들어 RT에서 1시간 동안 블롯을 배양하여 멤브레인을 차단합니다. 블롯을 덮을 수 있을 만큼 충분한 차단 버퍼를 사용합니다.
      참고: 단백질이 있는 막면이 아래를 향하지 않도록 염색 상자에 멤브레인을 똑바로 세우도록 주의하십시오.
   3. 4°C에서 효모에 반응하는 히스톤 변형 특이적 항체로 염색 상자의 블롯을 밤새 배양합니다. 제조업체 사양에 따라 TBS 차단 버퍼에 항체를 희석합니다. 또한 변형 특이적 항체와 다른 숙주 종에서 제기된 반총 H3와 같은 적절한 핵 장전 제어를 포함합니다. 예를 들어, 토끼에서 발생한 항-H3S10ph 항체로 H3S10ph를 프로빙하는 경우, 생쥐에서 발생한 항-총 H3 항체를 로딩 대조군으로 사용합니다. 필요에 따라 모든 블롯에 대해 이 작업을 반복합니다.
      참고: 항체 희석제는 한 달 이내에 총 3회 재사용할 수 있습니다. 4°C에서 보관하십시오.
   4. 집에서 만든 TBS + 0.1% 폴리소르베이트 20(TBST)에서 멤브레인을 RT에서 흔들면서 5분 동안 4번 세척합니다.
   5. RT에서 1시간 동안 제조업체가 지정한 희석액(당나귀 항토끼 680 및 당나귀 항-마우스)으로 형광 2차 항체로 블롯을 배양합니다.
      참고: 형광 2차 항체는 보관과 사용 모두에서 빛으로부터 보호되어야 합니다. 어두운 플라스틱 상자에 배양을 수행하거나 알루미늄 호일로 덮으십시오.
   6. TBST로 멤브레인을 4회 5회 세척하고 RT에서 흔들면서 TBS로 5분 동안 세척합니다.
   7. 2분 동안 형광 웨스턴 블롯 이미징 시스템에서 블롯을 시각화합니다. 항토끼 680 및 항마우스 800 2차 항체를 각각 800nm 및 700nm 채널에서 시각화합니다.
      참고: 복제는 섹션 1부터 독립적으로 수행됩니다. 이러한 실험에서 적절한 데이터 해석을 위해서는 항체 신호 반응이 신호 반응이 선형인 범위 내에 있는지 확인해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x Running Buffer			: 글리신 141.65g (ThermoFisher BP381-1), 티즈마 염기 30.3g (Sigma-Aldrich T6066), 도데실황산나트륨 10g (Sigma-Aldrich L3771) 및 탈이온수 1L, pH 8.8.
12% 폴리아크릴아미드 겔	BIO-RAD	456-1041
2-메르캅토에탄	Sigma-Aldrich	M3148
안티아세틸-히스톤 H3(Lys14) 기본 항체	MilliporeSigma	07-353 (Lot No. 2762291)	Dilution: 1/1000
anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) primary antibody	Abcam	ab109463 (로트 번호. GR187780)	Dilution: 1/2000
anti-acetyl-histone H4 (Lys12) primary antibody	Abcam	ab46983 (로트 번호. GR71882)	Dilution: 1/5000
anti-dimethyl-histone H3 (Lys36) primary antibody	Abcam	ab9049 (로트 번호. GR266894, GR3236147)	Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody	Abcam	ab24834 (로트 번호. GR236539, GR174196, GR3194335)	핵 장전 제어; 희석: 1/2000
anti-phospho-histone H2B (Thr129) primary 항체	Abcam	ab188292 (Lot No. GR211874)	Dilution: 1/1000
anti-phospho-histone H3 (Ser10) Primary Antibody	Abcam	ab5176 (로트 번호. GR264582, GR192662, GR3217296)	희석: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
원심분리기 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
당나귀 안티 마우스 IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (로트 번호 C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution: 1/5000
donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	희석 : 1 / 2500
에탄	시그마-알드리치	E7023
매우 두꺼운 오점지(여과지)<	1703968
Immobilon-FL 전사 멤브레인	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL 글리세롤, 1.2 mL 0.5M Trizma 염기 pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632) 및 2.1mL 탈이온수.
메탄	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀	BIO-RAD	1658004
멀티채널 피펫	Eppendorf	2231300045
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	A. Gitler의 선물		<
Sigma-Aldrich	P4338	50% w/v 솔루션을 준비합니다.
Ponceau S Stein	Sigma-Aldrich	P3504	혼합: 0.5g 0.1% w/w Ponceau S 염료, 5mL 1% v/v 아세트산(Sigma-Aldrich 320099) 및 500mL 탈이온수.
PowerPac 기본 전원 공급 장치	BIO-RAD	164-5050
도데실황산나트륨 로딩 버퍼			-20 oC에서 보관하십시오. 6X, 믹스: 도데실황산나트륨 1.2g, 브로모페놀 블루 6mg, DL-디티오트레이톨 0.93g, 탈이온수 2.1mL, 글리세롤 4.7mL 및 0.5M 트리즈마 염기 1.2mL, pH 6.8.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	0.2M 용액을 준비합니다.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), 900 mL 탈이온수.
TBS 차단 버퍼	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry 전기영동 전사 셀	BIO-RAD	170-3940
전송 완충액			mix: 글리신 22.5g, 티즈마 염기 4.84g, 메탄올 400mL, 도데실황산나트륨 1g, 탈이온수 1.6L.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, 용액: 트리즈마 염기 24g과 염화나트륨 88g(Sigma-Aldrich S7653)을 혼합합니다. 탈이온수를 1L까지 채웁니다.
WT 303 S. cerevisiae 효모	J. Shorter의 선물

올올td 스타일='너비:108pt;'>BIO-RAD올td 스타일='높이:15.75pt;너비:135pt;'>폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)