종양세포 침입의 3차원 스페로이드 모델 생성

초록

출처: Guyon, J., et al. 교모세포종에 대한 3D 스페로이드 모델. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 종양 세포 침입의 3차원 스페로이드 모델의 생성을 보여줍니다. 스페로이드는 인간의 뇌종양 세포에서 형성되며 콜라겐 매트릭스에 내장되어 있습니다. 스페로이드 말초의 종양 세포는 침습적 표현형을 채택하여 프로테아제를 분비하여 콜라겐을 분해하고 전진하여 주변 기질을 침범합니다.

프로토콜

1. 균일한 크기의 종양 스페로이드 생성

참고: 줄기 유사 세포는 B27 보충제, 헤파린, 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보완된 신경 기저 배지에서 배양됩니다. 이 세포는 배양에서 자발적으로 스페로이드를 형성합니다.

1. 종양 세포를 5mL 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 37°C에서 5분 동안 0.5-1mL 해리 효소로 세포를 배양합니다.
2. 4-4.5mL PBS로 세척하고 10mL의 완전 성장 배지(완전 신경기저 배지, cNBM)를 추가합니다.
3. trypan blue와 세포 계수 챔버 슬라이드가 있는 자동 계수 기술을 사용하여 세포를 계수합니다.
4. 스페로이드당 10⁴ 세포가 있는 100개의 스페로이드를 생성하려면(선호하는 크기에 따라) 8mL의 NBM에 있는 10⁶개의 세포를 2mL의 2% 메틸셀룰로오스와 혼합합니다.
5. 현탁액을 멸균 시스템 용기로 옮기고 멀티채널 피펫으로 100μL/웰을 96웰 원형 바닥 플레이트에 분주합니다.
6. 37 ° C, 5 % CO ₂ 및 95 % 습도에서 플레이트를 배양합니다. 동일한 크기의 스페로이드가 형성되며 3-4일 후에 사용할 수 있습니다.

2. 3차원 실험

1. 침공
   1. 준비
      1. <[>}}1mg/mL 최종 농도의 I형 콜라겐으로 얼음 위의 튜브에 콜라겐 매트릭스를 준비, 1x PBS, 0.023xV_콜라겐, 1M 수산화나트륨 및 멸균 H₂O. 용액을 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 500μL 튜브의 둥근 바닥 웰 플레이트에서 스페로이드를 수집하고 200μL 1x PBS로 2x 세척합니다.
      3. 스페로이드를 콜라겐 매트릭스 100μL에 조심스럽게 피펫팅하고 일반 96웰 플레이트의 웰 중앙에 삽입합니다.
      4. 콜라겐 겔을 37 °C에서 30 분 동안 배양한 다음 겔 위에 cNBM을 추가합니다. 억제제 또는 활성화제(예: 그림 1B, 1C에 표시된 바와 같은 염화수소)를 이 단계에서 배지에 추가할 수 있습니다.
   2. 이미지 획득 및 분석
      1. 콜라겐 함유 후 24시간 후에 명시야 모드에서 비디오 현미경으로 순차적으로 사진을 촬영합니다.
      2. 피지를 사용하여 수동 또는 반자동 방식으로 사진을 분석합니다. 수동으로 이렇게 하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 코어와 스페로이드의 전체 면적을 그리고 코어 면적과 함께 전체 면적을 빼서 각 스페로이드의 침습 면적을 측정합니다. 반자동 방식으로 이미지를 분석하려면 매크로를 사용하여 침입 영역을 확인합니다.

결과

그림 1: 증식, 침습 또는 이동 분석에서 교모세포종 P3 스페로이드. (A) 증식 분석. 왼쪽 패널: DMSO를 대조군으로 사용하거나 시간 0 또는 72시간에 20μM의 로테논(호흡 사슬 복합체 I 억제제)을 사용한 대표 사진. 오른쪽 패널: 이미지에서 파선으로 표시되는 스페로이드 영역 정량화. 규모 = 250 μm. (B) 콜라겐 매트릭스의 침입 분석. 왼쪽 패널: 20mM 염화수소가 있거나 없는 대표 사진, 시간 0 또는 24시간. 오른쪽 패널: 침입 영역의 정량화. 규모 = 100μm. (C) Matrigel 코팅에 대한 마이그레이션 분석. 왼쪽 패널: 시간 0 또는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	4°C에서 보관, 구 해리 효소
B27	Gibco	12587	-20 °C에서 보관, 사용
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	-20 °C에서 보관, 사용
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	4 °C
메틸셀룰로오스	시그마	M0512	2% 최종 농도를 위해 NBM에 희석<
Neurobasal medium Gibco 21103049 4°C에서 보관	Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 4°C에서 보관	Type I 콜라겐
코닝	354236	4°C에서 보관

전 해동 전 해동에서 보관td style='height:14.5pt;'>NBM Gibco 21103-049 4°C에서 보관