ELISA를 사용하여 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-Synuclein 검출

초록

출처: Bétemps, D., et al., Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 ELISA를 사용하여 형질전환 마우스의 뇌 조직에서 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-synuclein을 검출하는 절차를 보여줍니다. 단계에는 조직 균질화, 원심분리 및 α-synuclein 단백질의 ELISA 검출이 포함되어 질병 관련 형태를 정량화합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 해마를 해부할 때를 제외하고 끝이 함께 유지되는 두 개의 절벽을 사용하여 저배율 확대경(8X 배율)으로 얼음 위의 35mm 플라스틱 페트리 접시에 담긴 α-Synuclein(αS) 추출

1. 해마를 해부합니다. 뇌의 온전함을 보존하기 위해 10분을 초과하지 마십시오. 뇌를 오른쪽이 위로 향하게 놓고 다음 순서로 뇌 영역을 검색합니다.
   1. 바로 뒤에 있는 집게를 사용하여 두 개의 후각 전구 중 하나를 분리합니다. 뇌를 아래쪽으로 움직여 뇌에서 분리한다. 두 번째 전구에 대해 이 작업을 반복합니다.
   2. 두 피질 사이에 집게를 부드럽게 끼우고 두 피질의 해리를 용이하게 하기 위해 앞으로 움직입니다. 하나의 집게로 뇌를 제자리에 유지하고 다른 집게를 사용하여 피질과 해마를 분리합니다.
   3. 집게를 피질 아래 2mm에 놓습니다. 해마 상단이 보일 때까지 겸자에 부드러운 압력을 유지합니다. 피질의 첫 번째 부분을 떼어내고 두 번째 부분으로 반복합니다. 겸자를 사용하여 해마에서 시작하여 뇌 앞쪽으로 이동하는 두 개의 피질을 분리합니다.
   4. 열린 집게를 해마 중 하나 주위에 놓습니다. 해마 아래쪽에 있는 겸자를 닫은 다음 부드럽게 제거하여 가능한 한 많이 회복합니다. 두 번째 해마에 대해 절차를 반복합니다.
   5. 열린 집게를 선조체 중 하나 아래에 놓고 뇌에서 부드럽게 분리합니다. 집게를 사용하여 선조체에 남아 있는 피질을 제거합니다. 두 번째 선조체에 대해 이 절차를 반복합니다.
   6. 집게를 사용하여 소뇌의 윤곽을 2mm 부드럽게 눌러 뇌에서 쉽게 분리할 수 있도록 합니다. 집게를 소뇌 바로 뒤에 놓고 집게를 앞으로 움직여 제거합니다.
   7. 겸자의 넓은 부분을 사용하여 뇌간을 들어 올려 뇌간과 연결되는 위치를 명확하게 확인합니다. 접합부를 세로로 절개한 다음 뇌간을 제거합니다.
   8. 집게를 4개의 둥근 구조로 구성된 중뇌 뒤에 놓습니다. 중뇌가 나머지 뇌에서 완전히 분리될 때까지 수직으로 절개합니다.
2. 사용 가능한 조직의 수에 따라 고염(HS) 완충액에서 다양한 비율(중량/부피)의 균질액을 준비합니다: 10 - 30 mg 사이의 중량은 5% 균질산염, 30 - 80 mg 사이의 중량은 10%, 80 mg 이상의 중량은 20%입니다.
   1. 절개된 뇌 영역에 적절한 부피의 HS 완충액을 추가하여 예상되는 균질산염 %를 얻습니다.
   2. 소용돌이를 일으키고 조직이 HS 완충액에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.
   3. 절개된 뇌 영역 또는 경추 척수에서 준비한 샘플을 붕규산 유리관과 두 개의 절굿공이 A와 B로 구성된 조직 분쇄기로 균질화합니다.
   4. 각 뇌 영역을 튜브에 직접 부술 수 있도록 붓습니다. 유봉 A를 튜브에 삽입하고 집어넣습니다. 이 동작을 약 10회 반복하여 조직을 분리한다. 그런 다음 유봉 B를 사용하여 추가로 20번의 움직임으로 조직을 계속 분쇄합니다. 1ml 전사 피펫을 사용하여 균질액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.
3. 1,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 분쇄되지 않은 뇌 조각을 제거합니다. 상층액을 회수하여 200μl 분취량으로 나누고 후속 분석을 위해 -80°C로 유지합니다.

1. ELISA

1. 에 의한 αS 검출코팅 항체를 0.01ng/ml로 희석합니다. 50 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ 완충액(pH 9.6)에서 anti-αS rabbit polyclonal 또는 monoclonal clone 42 항체를 사용합니다.
2. 96웰 마이크로플레이트를 이 코팅 용액 웰당 100μl로 코팅하고 4°C O/N으로 둡니다. 검출 항체 syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 또는 8A5를 사용하여 ELISA용 코팅 용액에 anti-αS 토끼 다클론 항체를 사용합니다. anti-αS monoclonal antibody clone 42를 anti-pSer129 αS 검출 항체와 함께 코팅 용액으로 사용합니다.
   참고: 필요한 경우 ELISA를 수행하기 전 일주일 동안 플레이트를 4°C에서 유지할 수 있습니다.
3. 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 0.05% Tween 20(PBST)의 인산염 완충 식염수 300μl로 플레이트를 5회 세척합니다. 이 단계부터 배양은 RT.
4. 웰당 200μl의 T20 PBS(인산염 완충 식염수) 차단 완충액을 추가합니다. 150rpm으로 1시간 동안 흔듭니다. PBST로 플레이트를 다섯 번 세척합니다.
5. 뇌 균질액을 희석하고(PBST BSA 1%에서 20% 균질산물의 1:50, 5% 균질산물의 1:25 1% 1% 희석) 1%를 희석하고 각 웰에 100μl를 추가합니다. 그런 다음 150rpm으로 흔들면서 2시간 동안 배양합니다. PBST로 플레이트를 다섯 번 세척합니다.
6. 재료 목록에 언급된 희석액으로 소 혈청 알부민(BSA) 1%와 함께 PBST에 다양한 αS 검출 항체를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 배양합니다. PBST로 플레이트를 다섯 번 세척합니다.
7. 150rpm으로 진탕하면서 1시간 동안 BSA 1%가 보충된 PBST에 1:8,000으로 희석된 anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG HRP conjugate를 추가합니다. PBST로 플레이트를 다섯 번 세척합니다.
8. 각 웰에 100μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 넣고 150rpm으로 흔들면서 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다.
9. 웰당 100 μl의 1 N HCl을 첨가하여 반응을 중지한 다음 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.
10. 데이터 분석을 위해 분석된 각 샘플에 대해 측정된 OD 값에서 마우스 뇌 샘플(빈 웰)을 제외한 모든 시약이 포함된 웰에서 얻은 OD 값을 뺍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB509		Abcam	ab27766	검출 항체 1/2000
AS11		Anses		검출 항체 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	검출 항체 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	검출 항체 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	검출 항체 1/1000
Syn514		Abcam	ab24717	검출 항체 1/500
Clone 42		BD Biosciences	610787	코팅 및 검출 항체 (1/2000)
8A5		Provided by Dr. Ander		검출 항체 1/2000
polyclonal anti-alpha syn antibody		Millipore	AB5038P	코팅 항체
안티 마우스 IgG HRP 켤레		Southern Biotech	1010-05
안티-토끼 IgG HRP 켤레		Southern Biotech	4010-05<
염소 안티 마우스 IgG HRP 켤레		Dianova	115-035-164
HS buffer	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	pH 7.5에서 조정하고 4°C
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS	인산수소이나트륨 1 mM	Euromedex	1309	pH 7.5
인산일칼륨 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl 137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
BSA		A7906
	Thermo Scientific	442404
탄산나트륨 십수화물	시그마	71360	2.86 g/L
중탄산나트륨	Merk	6329	3.36g/L, pH9.6
수퍼 블록 T20 PBS 차단 버퍼		Pierce	E6423H	10 X concentrated
TMB		Sigma	T0440	ELISA
TMB		Analytik Jena AG	847-0104200302	Ed
HCl 1N		Chimie plus	40030
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