암세포의 내부 경동맥 주입을 통한 뇌종양 전이 모델링

초록

출처: Lim, M., et al. 암세포의 내부 경동맥 주입에 의한 뇌 전이 모델링. J. Vis. Exp. (2022)

이 영상에서는 마취된 쥐가 암세포를 총경동맥(CCA)에 주입하여 뇌로의 표적 전달을 촉진하는 수술을 받습니다. 이 시술에는 경동맥의 정확한 봉합 및 조작이 포함되어 주입된 세포를 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 하여 시간이 지남에 따라 뇌의 종양 형성을 촉진합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사를 위한 암세포의 준비

참고: 본 연구에서는 인간 유방암 세포주인 BT-474(BT474)를 사용하였다. BT474는 10%의 소 태아 혈청과 1%의 인슐린이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 배지를 포함하는 완전 성장 배지에서 배양하였다. 세포는 공기 대기에서 5 % 이산화탄소와 함께 37 ° C의 인큐베이터에서 유지되었다. 위성 탠덤 반복 검사를 통해 세포주를 인증하고, 리포터 단백질(예: 루시페라아제)의 발현을 확인하고, 마이코플라스마 감염 여부를 확인합니다.

1. 주입 전에 10mL의 완전한 성장 배지 및 배양(37°C에서 5% 이산화탄소)을 사용하여 2.0 × 10^6 세포의 파종 밀도로 BT474 암세포를 70%-80% 포화도까지 시딩합니다.
2. 주입 당일에는 성장 배지를 버리고 세포 단층을 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척합니다.
3. 예열된 세포 배양 해리 시약 5mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 5분 후 플라스크를 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다.
4. 10% 소 태아 혈청을 함유한 완전 성장 배지 5mL를 첨가하여 해리 시약 활성을 억제합니다.
5. 세포 덩어리를 줄이기 위해 피펫팅으로 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
6. 세포 현탁액을 50mL 튜브에 옮기고 실온에서 3분 동안 180 x g로 원심분리합니다.
7. 상층액을 디캔팅하고 칼슘과 마그네슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 10mL에 세포 펠릿을 재현탁하여 세포 응집을 최소화합니다.
8. 세포 현탁액을 실온에서 180 x g로 3분 동안 원심분리합니다.
9. 상등액을 디캔팅하여 잔류 혈청/해리 시약을 제거하고 세포 펠렛을 3mL의 HBSS에 재현탁합니다.
10. 새로운 50mL 코니컬 튜브에 100μm 세포 여과기를 놓고 세포 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다.
    참고: 단세포 현탁액은 혈관 폐색과 주사 시 뇌졸중 위험을 최소화하는 데 필수적입니다.
11. Trypan Blue 배제를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산하고 표준 방법을 사용하여 혈구계를 계산합니다.
12. HBSS로 세포 현탁액을 2.5 x 10⁶ cells/mL의 세포 농도로 희석합니다.
13. 튜브를 얼음 위에 수평으로 유지하고 튜브를 주기적으로 부드럽게 흔들어 뭉침을 최소화합니다. 세포 현탁액은 최대 6시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
    참고: 흔들기는 수동으로 수행되었지만 낮은 rpm에서 셰이커를 사용하여 수행할 수도 있습니다.

2. 시술을 위한 마우스 준비

참고: 이 연구에서는 생후 4-5주 된 암컷 NOD scid 마우스를 사용했습니다. 소프트 다이어트 회복 식품(예: 다이어트 젤, 하이드로겔, 으깬 마우스 차우)을 시술 3일 전에 마우스에게 소개하여 시술 후 수유를 장려합니다.

1. 오토클레이브 수술 도구. 표면 소독제로 수술 부위와 장비를 분사하고 닦은 다음 70% 에탄올을 뿌립니다.
2. 저체온증을 방지하기 위해 수술 보드 아래에 동물 열 매트를 놓습니다. 수술 30분 전에 이 기능을 켜십시오. 표면 소독제를 뿌려 수술 보드에 닦은 다음 70% 에탄올을 뿌립니다.
3. 회복을 위해 깨끗한 동물 사육장과 따뜻한 발열 패드를 준비하십시오.
4. 깨끗한 개인 보호 장비(가운, 마스크, 헤어네트, 장갑)를 착용하십시오. 깨끗한 검사 장갑과 '기구 팁 전용' 기술을 사용하여 절차 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하십시오.
5. 마우스가 페달 반사를 잃을 때까지 5L/min의 산소 흐름으로 2% 이소플루란을 사용하여 마취실로 마우스를 마취합니다.
6. 동물을 챔버에서 꺼내 콧방울에 넣고 남은 수술 절차를 위해 2L/min의 산소 흐름에서 2% 이소플루란을 전달합니다.
7. 식별을 위해 귀 펀치 마우스를 사용하고 전기 가위를 사용하여 목 부분의 털을 면도합니다. 테이프를 사용하여 노출된 피부의 과도한 수염을 청소합니다.
8. 필요한 마취제 및 진통제 용량을 계산하기 위해 마우스의 무게를 측정합니다. 피하 주사를 통해 부프레노르핀과 멜록시캄을 각각 50μg/kg 및 1mg/kg으로 투여합니다.
9. 마우스를 따뜻한 수술 보드로 옮기고 노즈콘을 테이프로 고정합니다.
10. 건조를 방지하기 위해 눈에 안구 윤활제를 바르십시오.
11. 먼저 수술 보드에 테이프로 감은 실을 사용하여 윗니를 걸고 앞다리와 뒷다리를 테이프로 감아 마우스를 부드럽게 고정합니다. 이 단계는 시술 중에 몸을 펴고 목을 곧게 유지합니다.
12. 아래 설명된 대로 수술 전 피부 준비를 수행합니다.
    1. 국소 소독제(포비돈 요오드)로 목을 닦아 피부 미생물 농도를 줄이고 늘어진 모발을 제거합니다. 절개 부위의 재오염을 방지하기 위해 피부 중앙에서 청소하고 바깥쪽으로 작업합니다. 70% 에탄올을 사용하여 이 과정을 반복합니다. 소독을 위해 요오드와 에탄올을 번갈아 세 번 수행합니다.
    2. 동물에게 수술용 드레이프를 씌웁니다. 이것은 멸균 종이 타월 또는 오토클레이브 백 조각으로 자르고 만듭니다.
13. 수술 도구를 위한 멸균 종이 타월이나 오토클레이브 백을 배치하십시오.
14. 절차를 계속하기 전에 충분한 마취를 보장하기 위해 '핀치 테스트'를 통해 반사 를 확인하십시오.

3. 내부 경동맥 주사

참고: 이 실험에서는 주입 절차를 용이하게 하기 위해 31G 주입 캐뉼라와 발 활성화 주사기 드라이버 설정을 사용했습니다. 이 설정은 선택 사항이며 사용자는 31G 인슐린 주사기를 사용하고 3.11 및 3.12 단계를 건너뛸 수 있습니다. 주입 캐뉼라를 준비하려면 두 쌍의 봉합 클램프를 사용하여 31G 바늘의 주사기 피팅 부분에서 바늘 부분을 당겨 분리합니다. 다음으로, 바늘 부분을 약 10cm 길이의 미세한 주입 튜브의 한쪽 끝에 부착합니다.

1. 해부 현미경을 마우스 위에 놓습니다.
2. 가위를 사용하여 턱 아래 5mm에서 흉곽까지 목 부위의 정중선을 따라 15mm씩 수직으로 절개합니다.
3. 두 쌍의 각진 집게를 사용하여 피부와 밑에 있는 타액선을 분리하고 견인기를 적용하여 기관이 노출되지 않도록 합니다. 다음 단계에서는 기관과 평행한 경동맥초를 노출시킵니다. 위치
4. 두 쌍의 미세한 각도의 집게를 사용하여 기관에 인접한 근육과 지방 조직을 뭉툭하게 절개하여 오른쪽 경동맥 수초를 노출시킵니다. 경동맥초는 총경동맥, 정맥, 미주신경을 덮고 있는 섬유층으로, 이 다발은 밝은 빨간색의 총경동맥으로 시각화할 수 있습니다. 이 연구에서는 오른쪽 경동맥에 주사를 수행했습니다.
5. 주변 근막의 경동맥 분기점으로 가는 총경동맥 꼬리의 일부를 제거하고 미주신경과 정맥에서 분리합니다.
6. 경동맥 분기점(경동맥 외부와 내부 경동맥을 연결하는 접합부)을 주변 신경과 근막에서 분리하고 제거합니다. 외부 경동맥 아래에 가는 집게를 놓고 동맥 아래에 실크 봉합사(5-0 두께)를 통과시킵니다. 봉합사를 매듭짓고 조이고 여분의 선을 자릅니다.
   참고: 이 결찰(L1)은 주입액이 외부 경동맥을 통과하는 것을 방지합니다.
7. 총경동맥 아래에 가는 집게를 놓고 동맥 아래에 실크 봉합사(5-0 두께)를 통과시킵니다. 매듭을 묶고 제안된 주입 부위에 가까운 위치에서 봉합사를 조입니다. 여분의 봉합사를 자르고 약 10mm의 선을 남깁니다.
   참고: 이 두 번째 결찰(L2)은 주사 후 혈류와 출혈을 제한합니다. 또한 주사 중 경동맥을 배치하고 유지하는 데 사용됩니다.
8. 약 10mm x 5mm의 (오토클레이브) 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 스트립을 자르고 적십니다. 스트립을 4mm x 5mm, 2-3mm 두께로 접고 제안된 주사 부위의 경동맥 아래에 놓습니다. 이것은 주입하는 동안 혈관을 지지할 것입니다.
9. 제안된 주사 부위의 총경동맥 주부에 느슨한 매듭이 있는 세 번째 결찰(L3)을 배치합니다. 이것은 주입 후에만 조여집니다(단계 3.16에서).
10. 세포 현탁액을 부드럽게 교반하고 200μL의 세포 현탁액을 인슐린 주사기(31G 바늘 포함)로 끌어옵니다.
11. 활성화 풋 페달에 연결된 주사기 드라이버에 주사기를 로드합니다.
12. 31G 바늘이 있는 미세한 캐뉼라를 주사기에 부착하고 라인을 프라이밍합니다.
13. 경동맥이 올바른 위치에 있고 압력이 가해져 있는지 확인하십시오.
14. 두 개의 가는 각진 집게를 사용하여 하나는 첫 번째 결자 끝을 부드럽게 팽팽하게 당기고 다른 하나는 31G 바늘을 잡고 구멍이 나지 않도록 주의하면서 베벨이 있는 바늘을 혈관 내강에 천천히 삽입합니다.
15. 100μL의 세포 현탁액(1.13단계부터)을 10μL/s의 속도로 총경동맥에 천천히 주입합니다. 이것은 2.5 × 10^5 세포를 혈관으로 전달합니다. 성공적인 주사는 경동맥 혈관에서 혈액을 제거하는 {{TAG_395 TAG_398}}{{}}를 시각화합니다.
16. 역류와 출혈을 방지하기 위해 바늘을 빼낸 직후 느슨한 합자(L3)(3.9단계부터)를 부드럽게 들어 올려 조입니다. 여분의 봉합사를 다듬습니다.
    참고: 바늘을 뽑은 후 소량의 피가 분출되는 것을 관찰하는 것은 정상입니다. 그러나 세 번째 결찰을 조인 후 활동성 출혈이 없어야 합니다.
17. 축축한 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 조각을 제거합니다.
18. P200 피펫을 사용하여 150-200 μL의 멸균수 또는 식염수로 수술 구멍을 두 번 헹굽니다.
19. 출혈 여부를 다시 확인한 다음 견인기를 제거하십시오.
20. 연조직, 타액선, 피부를 경동맥과 기관 위의 재배치한다.
21. 봉합사 바늘 홀더, 집게, 흡수성 또는 비흡수성 6/0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 절개 부위의 피부층을 연속적인 패턴으로 봉합합니다.
22. 캐뉼러 바늘 주사기를 버리고 다음 마우스를 위한 새 설정을 준비합니다. 새 주사기를 사용하면 각 마우스에 주입되는 세포의 수가 일정하게 유지됩니다.
    참고: 절차의 대표적인 스냅샷은 혈관이 주사 또는 출혈의 누출로 표시된 바늘에 의해 구멍이 뚫리거나 찢어진 경우 절차가 실패한 것으로 간주됩니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 세 번째 결찰을 즉시 조여 추가 출혈을 방지해야 합니다. 봉합사를 조인 후에도 출혈이 지속되면 동물을 펜토바르비탈로 안락사시켜야 합니다.

4. 주사 후 회복

1. 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀(50 μg/kg) 및 멜록시캄(1 mg/kg) 피하 주사를 주사합니다.
2. 마취에서 회복하기 위해 동물을 따뜻하고 깨끗한 우리로 옮깁니다. 동물이 깨어난 후 차분한 활동(옹기종기 모여 있거나 비활동적이거나 천천히 움직이는 것)을 하는 것은 정상입니다.
3. 30-45분 후 마우스를 장기 보관 시설로 옮깁니다.
4. 수술 후 최소 일주일 동안 생쥐에게 부드러운 식단(다이어트 젤, 하이드로겔, 매시)을 제공하고 매일 신체 상태를 확인하고 상처 부위 주변의 뇌졸중, 감염 및 출혈 징후가 있는지 특히 주의하십시오.
5. 수술 이틀 후, 동물은 활동이 감소하고, 털이 약간 주름지며, 수술 전 체중의 15%가 감소하는 것이 일반적입니다. 통증을 관리하고 회복을 돕기 위해 수술 후 2-3일 동안 매일 진통제(meloxicam)를 투여합니다.
6. 위치 3일차부터 동물은 활동을 회복하고, 먹이를 주고 몸을 털어놓는 빈도를 늘리고, 체중을 회복해야 합니다. 수술 후 4일 후 신체 상태 결핍(통증, 웅크리기, 비활동, 체중 감소)이 지속되는 동물을 복강내 주사를 통해 200mg/kg 주사하여 안락사시킵니다.
7. 종양 생착 및 진행은 생물 발광 영상, MRI 또는 PET/MRI와 같은 마취 및 선택한 영상 방식을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이러한 이미징을 수행하기 위한 요구 사항과 능력은 본질적으로 개별 프로젝트의 목표와 수행되는 시설에 따라 달라지며, 사용된 세포주, 관련 방사성 화학 및 핵 이미징 시설의 접근성에 따라 다릅니다.
   참고: 일부 동물은 성공적인 시술에도 불구하고 잘 반응하지 않고 뇌졸중을 경험할 수 있습니다. 시술 후 신경학적 고통 증상(고개를 돌리거나 한쪽으로 당기는 것, 빙빙 도는 행동, 구르기, 몸부림, 운동 기능 상실)을 보이는 동물은 즉시 안락사시켜야 합니다.

결과

그림 1: 뇌 전이를 위한 내부 경동맥 주입 프로토콜의 개략도. 외부 경동맥 결찰술을 동반한 내부 경동맥 주사는 다양한 원발성 암으로부터 뇌 전이 모델을 안정적으로 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 경동맥에 3개의 결찰자가 배치됩니다(그림에서 L1-L3으로 주석이 표시됨).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II 인슐린 주사기	BD	326103
앵글 집게	Proscitech	T67A-SS	미세 뾰족하고 톱니 없이 각진 것, 18mm 팁, 길이 128mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) 유방암 세포주	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Dissection microscope
Ear 펀처
전기 클리퍼
각도 집게	Proscitech	DEF11063-07	각도 45 °, 팁 스무스, 팁 너비 : 0.4 mm, 팁 치수 : 0.4 x 0.3 mm, 길이 9cm
캐뉼러 용 미세 튜브, 튜빙 OD (in) 1/32, 튜빙 ID (in) 1/100in	콜 파머	EW-06419-00
태아 소 혈청	ThermoFisher Scientific	26140079
칼슘과 마그네슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14170120
이소플루란
Kimwipes 낮은 보푸라기 일회용 와이퍼	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
노즈 콘			마이크로 fuge 튜브
PAA 안구 윤활제(Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
포비돈-요오드 용액	Betadine	2505692
PPE (장갑, 마스크, 가운, 헤어네트)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal Saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
접착 테이프
수술용 보드			오토클레이브 백으로 감싼 도마.
외과 용 가위	Proscitech	T104	팁 치수 (LxD) : 38x7mm, 길이 115mm
봉합 집게 / 곡선 브로피 집게	Proscitech	T113C	곡선, 둥근 좁은 2mm 팁, 톱니 포함, 길이 165 mm
Proscitech	TC1322-180	길이 190mm, 래칫 클램프
발 페달이 있는 주사기 드라이버/ UMP3 울트라 마이크로 펌프	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 조직 배양 플라스크	ThermoFisher Scientific	156499
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