인간 뇌 조직에서 분리된 뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석

초록

출처: Wulf, M., et.al. 뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세해부 기반 프로토콜. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 인간의 사후 뇌 조직에서 분리한 뉴로멜라닌 과립(NMG)의 펩타이드 시료 분석을 보여줍니다. 펩타이드는 먼저 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분리한 다음 질량 분석법으로 분석하여 질량 대 전하 비율(m/z)을 측정합니다. 표적 펩타이드는 번역 후 변형을 식별하기 위해 단편화되고 결과 데이터는 NMG의 단백질체 프로파일을 결정하기 위해 참조 데이터베이스와 비교됩니다.

프로토콜

1. 트립틱 소화

1. 얼음에서 샘플을 해동합니다.
2. 진공 농축기에서 샘플을 완전히 건조시킵니다.
3. 50 μL의 적절한 분해 완충액(예: 50 mM 중탄산암모늄)으로 시료를 채웁니다.
4. 200mM 1,4-디티오트레이톨 1.25μL를 첨가한 후 써모믹서를 사용하여 60°C 및 300rpm에서 30분 동안 샘플을 배양하고 나중에 실온(RT)으로 냉각합니다.
5. 그런 다음 1.36μL 0.55M 요오드아세트아미드를 첨가한 후 어둠 속에서 30분 동안 RT에서 샘플을 배양합니다.
6. 샘플에 적절한 양의 트립신을 첨가하고 37°C에서 하룻밤(~16시간) 샘플을 배양합니다.
참고: 1,000,000 μm²의 경우 0.1 μg의 트립신이 충분한 것으로 나타났습니다.
7. 2.6μL의 10% 트리플루오로아세트산(TFA)을 샘플에 추가하여 분해를 중지합니다(0.5% TFA의 말단 농도).
8. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 정의된 최종 부피까지 샘플을 0.1% TFA로 채웁니다. NMG 샘플은 최대 20μL까지 충전되었으며 그 중 5μL는 하나의 질량 분석(MS) 실험에 사용되었습니다.
9. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오. 아미노산 분석 또는 다른 적절한 정량 분석법(예: Direct Detect)을 통해 펩타이드 농도를 측정합니다.
참고: 낮은 샘플 양은 언급된 기술을 사용하여 정량화하지 못할 수 있습니다. 동일한 시료 주입을 보장하기 위해 각 시료에는 동일한 양의 분리된 조직이 포함되어야 하며 모든 시료는 동일하게 처리되어야 합니다.

2. 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석

법

참고: 다음 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 질량 분석(MS) 분석은 여기에 사용된 트래핑 컬럼 장치 및 질량 분석기를 사용하여 특정 LC 시스템에 최적화되어 있습니다(재료 표 참조).). 다른 LC 및 MS 시스템의 경우 파라미터를 조정하는 것이 좋습니다.

1. Xcaliber 소프트웨어를 사용하여 HPLC 설정을 다음과 같이 조정합니다.
   1. 트랩 열: 온도를 60°C로, 유속을 30μL/min으로, 버퍼를 0.1% 트리플루오로아세트산으로 설정합니다.
   2. Analytical C18 역상 컬럼: 온도를 60°C로, 유속을 30μL/min으로, 버퍼 A를 0.1% 트리플루오로아세트산으로, 버퍼 B를 84% 아세토니트릴로, 98분 동안 버퍼 B를 5%-30%로 구배로 설정합니다.
      참고: 그라디언트의 적응은 불가피할 수 있으며 다른 조직이나 세포를 사용할 때 강력히 권장됩니다. 총 그래디언트 시간은 그래디언트 시작 시 샘플 로딩과 그래디언트 종료 시 샘플 세척으로 인해 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜의 총 그래디언트는 7분 샘플 로딩과 15분 동안의 추가 컬럼 세척으로 구성되며, 총 그래디언트 시간은 120분입니다.
2. HPLC 소프트웨어 로드맵 메뉴에서 찾을 수 있는 XCalibur 기기 설정을 사용하여 데이터 종속 수집(DDA) 방법을 만듭니다.
3. Global Parameters 탭에서 주입 모드 액체 크로마토그래피, 예상 LC 피크 너비(30초) 및 기본 전하 상태(2)를 정의합니다.
4. 스캔 매개변수 탭으로 이동하여 MS OT, MIPS, INTENSITY, CHARGE STATE, DYNAMIC EXCLUSION 및 ddMS2 OT HCD와 같은 스캔 및 필터를 언급된 순서대로 추가합니다.
   최적의 MS 및 DDA 설정은 사용되는 특정 질량 분석기와 샘플 유형에 따라 다를 수 있으므로 조정해야 합니다.
5. 불활성 질량 분광 유리 바이알 주입구에서 0.1% TFA의 정의된 부피로 200-400ng의 샘플 펩타이드를 용해하여 샘플을 준비합니다. 시료 양이 적어 농도 측정을 적용할 수 없는 경우 총 이온 전류(TIC)를 비교하여 동일한 시료 주입을 확인합니다.
   참고: 이렇게 하려면 적절한 소프트웨어(예: FreeStyle)에서 질량 분석 결과 파일을 열고 크로마토그램을 확인합니다. 강도는 모든 샘플에 대해 비슷해야 합니다. 대표적인 TIC가 그림 1에 나와 있습니다.
6. MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics, Proteome Discoverer와 같은 프로테오믹스에 적합한 소프트웨어를 사용하여 얻은 원시 데이터를 분석하고 연구 질문을 기반으로 통계 데이터 분석을 수행합니다.

3. MaxQuant

1. 로드를 클릭하여 원시 데이터 헤더의 MaxQuant 소프트웨어에 원시 파일을 로드합니다.
2. 실험 설정을 클릭하여 샘플 이름을 할당합니다.
3. 그룹별 매개변수를 정의합니다. 먼저 수정 사항을 추가합니다. 시료 처리로 인해 가변 변형으로 Deamidation (NQ), Oxidation (M) 및 Carbamidomethylation (N-term)을 선택하고 Carbamidomethylation (C)를 고정 변형으로 추가합니다.
4. Digestion(소화) 탭에서 Trypsin을 digestion enzyme(소화 효소)로 선택합니다.
5. Label Free Quantification 탭에 Label Free Quantification 옵션 LFQ를 추가합니다. 10개 이상의 파일을 처리해야 하는 경우 빠른 LFQ 옵션을 선택하여 처리 시간을 단축합니다. 단백질 정량화를 위한 척도로 iBAQ 옵션을 추가합니다.
6. 다른 모든 그룹별 매개 변수가 공장 설정에 남아 있는지 확인합니다.
7. 전역 매개 변수 탭으로 이동하여 시퀀스 탭의 uniprot.org 에서 파생된 FASTA 파일을 추가합니다. 그에 따라 식별자 규칙을 수정하고 분류 ID(이 경우 호모 사피엔스의 경우 9606)를 추가합니다.
8. 단백질 정량화를 위해 Unique 및 Razor 펩타이드를 선택하십시오.
9. 다른 모든 전역 매개 변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인합니다.
10. 시작을 클릭하고 Perseus에서 추가 분석을 위해 MaxQuant 분석 후 proteingroups.txt 출력을 검색합니다.

결과

그림 1: 120분 DDA 측정의 총 이온 전류(TIC).크로마토그램은 0분에서 ~105분까지의 머무름 시간 범위 동안 용리 펩타이드에 해당하는 이온의 상대적 풍부도를 보여줍니다. 메인 컬럼이 105^번째와 120^번째 분 사이에서 세척될 때 크로마토그램은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500
암모늄 바이카보네이	Sigma-Aldrich	A6141
포름산	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000<
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
트리플루오로아세트산	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
소프트웨어의 이름	Weblink/Company	Version
FreeStyle	써모 피셔 사이언티	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

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