$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 재현 가능한 크기의 종양 스페로이드 생성
- 170 x g합니다.
- NS를 분해하려면 500μL의 아큐타아제 용액을 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
- 종양 줄기 세포(TSM)로 accutase 용액을 중화하십시오 medium7 및 원심분리 355 x g.
- TSM 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁시킨 다음 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 주입합니다.
- 세포 현탁액을 희석하여 2.5-5 x 103 <span style='font-family:Roboto,sans-serif; 글꼴 크기 : 12pt; 글꼴 스타일 : 일반; 글꼴 변형 : 일반; 글꼴 무게 : 400; 텍스트 장식 : 없음; 수직 정렬 : 기준선; white-space:pre-wrap;' >cells/mL 및 시드 100 μL/웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 96웰 둥근 바닥 플레이트(Table of Materials). 적절한 세포 밀도를 사용하여 세포 파종 후 4일 후 직경 ~300μm의 개별 NS(매우 공격적인 신경교종 세포의 경우 250-500개 세포/웰)를 얻습니다.
- cell seeding 4일 후 도립 현미경을 사용하여 NS 형성을 육안으로 확인합니다.
2. 항체 라벨링 시약(ALR)/항체 복합체 준비 및 마이그레이션 분석 설정
- 각 시약에 필요한 부피를 분석하고 계산할 웰의 수를 고려하십시오. 음성 대조군에 필요한 우물도 포함합니다. 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 NS를 육안으로 확인하십시오.
- 바닥이 평평한 96웰 플레이트를 사용하십시오. 코팅을 수행합니다. 이 연구에서는 기저막 매트릭스(BMM)가 얇은 코팅으로 사용됩니다.
- 코팅이 준비되면 p200 팁으로 여분의 BMM 코팅을 제거하고 팁을 웰 가장자리에 놓고 바닥을 만지지 않도록 합니다. 여러 웰로 작업하는 경우 멀티채널 피펫을 사용하십시오.
- p200 팁을 자르고 선택한 각 웰에서 50μL의 셀 배지 + NS를 취하여 코팅된 평평한 바닥 웰로 옮깁니다. 각 웰에 NS의 존재 여부와 위치를 시각적으로 확인합니다.
참고: 각 NS는 우물 중앙에 위치해야 합니다. 옮기는 동안 우물 가장자리의 팁에 기대지 말고 바닥에 닿지 않도록 매체를 우물 중앙에 떨어뜨립니다. 이동성이 높은 세포의 경우, 표준 3회 복제보다 더 많은 수의 복제를 고려하십시오. 이는 NS가 우물의 가장자리에 너무 가까이 앉으면 이동하는 세포가 우물의 더 작은 영역을 덮을 수 있기 때문입니다. - ALR에 멸균수 100μL를 추가하여 시약을 재수화합니다(최종 농도 = 0.5mg/mL). 용액을 혼합하는 피펫. 참고: 시약은 빛에 민감합니다. 따라서 어둠 속에 보관하십시오. 남은 시약을 분취하고 -80 °C에서 보관하십시오(냉동 및 해동을 피하십시오).
- 둥근 바닥 멀티 웰 플레이트 또는 호박색 튜브의 적절한 완전 세포 성장 배지에 항체와 ALR을 혼합하고 빛으로부터 보호합니다. 최종 분석 농도의 3배에서 50 μL/well을 분주하기에 충분한 양을 준비합니다. RT에서 15분 동안 배양합니다.
- TSM 배지(또는 선택한 세포주에 적합한 세포 성장 배지)에서 배경 억제 시약(BSR)을 1.5mM(3x)로 희석하여 분석 종료 시 0.5mM의 최종 농도를 얻습니다.
참고: 시약은 빛에 민감합니다. 좋은 취급 절차는 위를 참조하십시오. - 각 웰에 BSR 50μL를 부드럽게 추가합니다.
- 각 웰에 ALR/항체 50μL를 부드럽게 첨가합니다. 시약이 혼합될 때까지 2-3분 정도 기다렸다가 도립 현미경을 사용하여 육안으로 확인하여 대부분의 복제 NS가 웰 중앙에 위치하는지 확인합니다.
- 거품이 생기지 않도록 하고 바늘을 사용하여 기포를 제거합니다. 인큐베이터 내에 배치된 라이브 셀 분석 기기에서 플레이트를 37°C, 5% CO2, 95% 습도.
3. 이미지 획득을 위한 Live-cell 분석 기기 설정
- 라이브 셀 분석 기기를 사용하여 플레이트를 스캔합니다(사양은 Table of Materials) 2.14단계 이후에 각각 설정된 침입 및 이동 분석의 시점 0(t0)부터 스캔 간격이 있습니다. 및 3.10. 최대 96시간.
참고: 침입 및 이동 분석이 시작된 직후 살아있는 세포 분석 기기를 폐기할 수 있는지 확인하십시오. 종양 유형에 따라 세포는 분석 설정에서 이미 1시간 이내에 NS로부터 침입하거나 이동하기 시작할 수 있습니다. - 라이브 셀 분석 기기 소프트웨어에서 Schedule to acquire 옵션을 선택합니다.. + 탭을 선택하고 옵션을 선택합니다. Scan on Schedule.
- 소프트웨어 창에서 Create or Restore Vessel, 옵션을 클릭하십시오. new.
- 침입 및 이동 획득을 위해 live-cell analysis instrument에서 특정 응용 프로그램을 선택합니다. 선택 Spheroid 스캔 유형, 4x 목표, Phase+Brightfield Green 이미지 채널. 선택 Dilution Cloning 스캔 유형, 4x objective 및 Phase 및 Green 마이그레이션 분석용.
- 플레이트 유형을 선택하고 플레이트 맵에서 강조 표시하여 스캔할 웰을 정의합니다.
- 스캔 빈도를 설정합니다(이 프로토콜의 실험에서 스캔 빈도는 침입의 경우 15분, 마이그레이션의 경우 30분이었습니다).
- <span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Add to Schedule 을 클릭하고 스캔을 시작합니다.