우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.
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방법 논문
히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리
이 논문에서
요약
초록
바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다.
Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다.
히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.
프로토콜
1. 솔루션의 준비
히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다.
- 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다.
- 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥.
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토론
여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 총 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 테스트하는 것이 중요하므로 단, 히드록 시아파 타이트의 각 준비는 약간 다른 구성과 용출 프로필을 가질 수 있습니다. 이것은 사용자가 원하는 핵산을 elute에 필요한 인산염 함유 버퍼의 특정 농도를 확인할 수 있습니다.
이 기법의 제한 요소를 사용할 수 칼슘 2의 수량 핵산의 인산 백본을 바인딩할 수 히드록 시아파 타이트에있는 + 이온입니다. 열에있는 히드록 시아파 타이트의 capacityamount은.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 카탈로그 번호 |
| 이코노 - 열 | 바이오 방사선 | 737-0717 | 0.7cm 아이디 패키지 / 2 |
| 히드록 시아파 타이트 | 바이오 방사선 | 130-0520 | DNA 학년 바이오 젤 HTP 젤, 100g/td> |
| 인산 나트륨, 일염기의 | VWR | VW1497 - 01 | 일수화물, 크리스탈 500g |
| 인산 나트륨, 이염 | VWR | VW1496 - 01 | 무수, 파우더 500g |
| DEPC - 처리된 물 | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS 솔루션 | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Invitrogen | AM9262 | 산도 8.0, 1L |
| Sigmacote | 시그마 - 올드 리치 | SL2 - 25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | 폴리스티렌, 무균 |
| BD 팔콘의 원심 분리기 튜브 | VWR | 21008-936 | 15ml, 무균 |
| 페놀 : 클로로포름 : Isoamyl 알코올 (25:24:1 V / V / V) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon 울트라 - 4 원심 장치 | Millipore | UFC803024 | Ultracel - 30 멤브레인 |
| 20X TE 버퍼, Rnase 무료 | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
참고문헌
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. ....
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