면역형광을 이용한 소장 신경내분비종양 스페로이드의 특성화

초록

출처: Ear, P. H., et. al. 소장 신경내분비종양 스페로이드의 확립 및 특성화. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 소장 신경내분비 종양 스페로이드의 면역 형광 염색을 보여줍니다. 스페로이드는 고정, 투과화 및 차단된 다음 1차 및 2차 항체와 함께 배양됩니다. 형광 현미경으로 핵을 장착하고 시각화하기 전에 염색하기 위해 염료를 첨가합니다.

프로토콜

1. 소장 신경내분비종양(SBNET) 수집 및 세포 해리

1. 외과병리학 핵심에서 종양 조직 확인 후 절제된 환자 SBNET 샘플을 얻습니다.
2. SBNET을 5mm 큐브로 자르고 원뿔형 튜브에 담긴 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)/F12 배지 25mL에 보관하여 실험실로 운반합니다.
3. 1%의 소 태아 혈청 또는 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구상구균) 및 1%의 글루타민(세척 배지)이 포함된 DMEM으로 종양을 옮기고 이 세척 배지에서 15분 동안 배양합니다.
4. 종양을 새 접시에 옮기고 멸균 곡선 가위를 사용하여 직경이 1mm 미만인 조각으로 다집니다.
5. 다진 조직을 25mL의 세척 배지가 들어 있는 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
6. 4°C에서 15분 동안 500 x g에서 샘플을 원심분리합니다.
7. 상등액을 버리고 콜라겐 분해 효소(100 U/mL) 및 DNase(0.1 mg/mL)를 포함하는 10mL의 세척 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
8. 다진 종양을 37°C 인큐베이터에서 1.5시간 동안 천천히 흔들어(50rpm)하여 소화합니다.

2. Extra Cellular Matrix (ECM)에서 SBNET을 종양 스페로이드로 배양

1. 분해 완료 후(step 1.8), 4°C에서 15분 동안 500 x g에서 원심분리한 후 상등액을 버리고 펠릿을 15mL의 Wash Medium에 재현탁합니다.
2. 새로운 50 mL 튜브 위에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고 10 mL의 세척 배지를 셀 스트레이너 위로 옮깁니다. 그물 셀이 플라스틱 튜브 측면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 플라스틱 튜브의 측면을 덮도록 세척 매체를 소용돌이칩니다.
3. 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
4. 500 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 가열하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 200μL의 세척 매체(총 부피는 ~ 250μL)에 재현탁한 후 얼음 위에 놓습니다.
5. 5 μL의 세포를 500 μL의 세척 배지(1/100 희석 계수)로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수에 희석된 세포를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 구합니다. 100을 곱하여 희석 계수를 수정합니다.
6. 2.5단계에서 얻은 mL당 세포 수에 2.4단계에서 얻은 현탁액 내 세포의 총 부피(~ 250μL)를 곱합니다.
7. 500 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 하고 상등액을 버리고 세포를 액체 ECM(1 x 10⁶ cells/mL)에 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.
8. ECM에서 5-20 μL의 SBNET 스페로이드를 96-well plate로 옮기고 플레이트를 37°C incubator에 5분 동안 넣어 액체 ECM이 응고되도록 합니다.
9. 96-well plate의 각 well에 200 μL의 SBNET 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamine + 10 mM nicotinamide + 10 μg/mL 인슐린)를 추가합니다. ECM에 SBNET 스페로이드를 함유하고 있습니다.
10. 또는 인간 간 또는 췌장 오가노이드를 성장시키는 것으로 이전에 설명되고 Table of Materials에 나열된 것과 유사한 줄기세포 배지에서 SBNET 오가노이드를 배양합니다.
11. 5-7일마다 미디어를 교체하십시오.

3. 면역형광에 의한 SBNETS 스페로이드의 특성화

1. P1000 피펫을 사용하여 ECM에서 성장한 오가노이드를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
2. 1,500 x g에서 1분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
3. 인산염 완충액 식염수 또는 PBS 1mL를 첨가하여 오가노이드 배양액을 세척하고, 1,500 x g에서 1분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거합니다.
4. 500μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 오가노이드를 수정하고 15분 동안 배양합니다.
5. PBS 1mL로 배양액을 2회 세척합니다.
6. PBS 500μL + 3% 소 혈청 알부민 또는 BSA + 0.1% 트리톤 X 100을 5분 동안 첨가하여 배양을 투과합니다.
7. 그런 다음 PBS 1mL + 3% BSA로 3회 세척합니다.
8. 항체 완충액(2.5% 소 혈청 알부민, 0.1% 아지드화나트륨, 25mM 트리스 pH 7.4, 150mM 염화나트륨)에서 1/600 희석에서 시냅토피신(SYP) 또는 크로모그라닌 A(CgA) 및 소마토스타틴 수용체 2(SSTR2)에 대한 1차 항체로 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 튜브당 300μL 이상의 항체 용액을 사용하십시오.
9. PBS 1mL + BSA 3%로 3회 세척합니다.
10. 항체 완충액에서 1/500 희석으로 FITC에 결합된 2차 항체를 1시간 동안 배양합니다. 튜브당 300μL 이상의 항체 용액을 사용합니다.
11. PBS 1mL + BSA 3%로 3회 세척합니다. 반드시 흡입하여 모든 상층액을 버리십시오.
12. 핵 염색 DAPI를 포함하는 5μL의 장착 매체를 추가합니다.
13. P20 피펫을 사용하여 4.12단계에서 5μL의 SBNET 스페로이드를 유리 슬라이드로 옮기고 커버 슬립으로 밀봉합니다.
14. 10x, 20x 또는 40x 대물렌즈를 사용하는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	녹색 형광단에 2차 항체 커플
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	항체 염색
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	형광 현미경
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Collagenase	Sigma	C0130	종양 조직
DMEM	Gibco	11965-092	조직 준비
DMEM/F12	Gibco	11320-033	오가노이드 배양을
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
FBS	Gibco<	배양 배지용 시약
형광 현미경	Olympus	CKX35	SBENT 스페로이드
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
Insulin	Sigma	I0516	배양 배지
Matrigel	Corning	356235	오가노이드
마운팅 매체(VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	핵 염색이 있는 labelled-cells에 대한 고정제
Nicotinamide	Sigma	72340	배양 배지용 시약	파라포름알데히드	Electron Microscopy Sciences	15710
세포를 고정하는 시약
PEN / STREP	Gibco	15140-122	배양 배지
SSTR2 항체	GeneScritp	A01591	IF
Synaptophysin 항체	Abcam	32127	IF
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	세포를 투과시키는
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	동결 해동 후 SBNET 스페로이드 생존율 향상

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