Detection of Oxygen Consumption Rate in Acute Mouse Brain Slices (급성 마우스 뇌 절편의 산소 소비율 측정)

초록

출처: Zhi, L. et al., 성체 마우스의 급성 선조체 절편의 산소 소비율 측정. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 마우스 선조체 뇌 절편에서 미토콘드리아 산소 소비율(OCR)을 측정하는 방법을 보여줍니다. 티슈 플레이트와 센서 카트리지를 준비하고 플럭스 분석기에 로드하는 단계를 자세히 설명하고 OCR 패턴의 기초가 되는 세포 과정을 설명합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 카트리지 센서에 수화를 넣으십시오(분석 1일 전)

1. 세포외 플럭스 분석 키트(재료 표 참조)를 열고 센서 카트리지(녹색)와 유틸리티 플레이트(투명; 그림 1A). 센서 카트리지를 한쪽에 놓고(센서 위로) 센서를 만지지 마십시오.
2. 유틸리티 플레이트의 각 웰에 600μL의 캘리브런트 용액(pH 7.4)을 추가합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 용액에 담그십시오. 유틸리티 및 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다(그림 1B).
3. 보정 용액의 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름으로 세포 외 플럭스 분석 키트를 밀봉한 다음 CO₂ 또는 산소가 보충되지 않은 37°C 인큐베이터에 밤새 넣습니다.

2. 조직 플레이트를 준비합니다(분석 당일)

1. 섬 캡처 마이크로플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 섬 플레이트를 꺼냅니다.
2. 산소가 공급된 인공 뇌척수액(ACSF, 조성 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 25 mM 포도당, 10 mM HEPES, pH 7.2) 완충액을 50 mL 튜브에서 37 °C까지 가열합니다. 그런 다음 BSA를 최종 농도인 4mg/mL에 첨가하여 호흡 완충액을 준비합니다. 일반적으로 한 접시에 50mL면 충분합니다.
3. 625μL의 호흡 완충액(25mM 포도당 및 4mg/mL BSA가 함유된 사전 산소화된 ACSF 완충액)을 섬 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 추가하고 플레이트를 흔들지 마십시오. 센서 카트리지 상단에 잔류 방울이 없고 각 웰의 버퍼에 기포가 없는지 확인하십시오.

3. 급성 선조체 슬라이스 준비 및 절제 슬라이스 배치

1. 경추 탈구 후 마우스의 목을 베고 즉시 10mL의 얼음처럼 차가운 사전 산소 절단 용액(125mM NaCl, 2.5mM KCl, 26mM NaHCO₃, 3.7mM MgSO₄, 0.3mM KH₂PO₄, 10mM 포도당, pH 7.4)에서 뇌를 해부합니다.
2. 섹션의 코로나 선조체 슬라이스는 얼음처럼 차가운 사전 산소 절단 용액에서 150μm 두께의 제조업체의 지침(재료 표 참조)에 따라 비브라톰이 있습니다.
3. 50mL의 산소화된 ACSF(125mM NaCl, 2.5mM KCl, 26mM NaHCO₃, 2.4mM CaCl₂, 1.3mM MgSO₄, 0.3mM KH_2PO4, 10mM 포도당, 2mM HEPES, pH 7.4)에서 슬라이스를 회수하고 실온(RT)에서 최대 30분 동안 용액에 보관합니다.
4. 회복 후 슬라이스를 5mL의 호흡 완충액이 있는 35mm x 10mm 페트리 접시로 옮깁니다.
5. 스테인리스 스틸 생검 펀치(예: 직경 1.5mm)를 사용하여 절편화된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 슬라이스를 버퍼에 유지하면서 펀치로 부드럽게 누릅니다. 펀치가 조직을 절단할 수 있을 만큼 세게 눌러졌는지 확인하십시오. 나머지 조직을 제거하고 펀치를 들어 올린 다음 버퍼에 있는 원형 조직 조각을 제거합니다.
6. 1mL 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 1.5-2.0mm 직경의 구멍을 만들고 이를 사용하여 펀칭된 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮깁니다. 천공된 뇌 조직 한 조각을 흡입하고 조직을 캡처 화면의 메쉬 면에 조심스럽게 놓습니다(그림 2A). 캡처 화면은 한쪽 면에 메쉬가 부착된 원형 플라스틱 조각입니다.
   참고: 캡처 화면은 마이크로플레이트 팩에 포함되어 있습니다(재료 표 참조).
7. 종이 티슈를 사용하여 캡처 화면을 잠시 말리십시오. 수분이 제거되면 조직이 끈적거리게 되어 슬라이스가 메쉬 중앙에 부착될 수 있습니다. 그렇지 않으면 손상될 수 있으므로 슬라이스를 너무 많이 건조시키지 마십시오.
8. 핀셋으로 캡처 화면 슬라이스 면을 아래로 향하게 잡고 인큐베이팅 섬 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다(그림 2B). 슬라이스를 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오. 그렇다면 스크린을 꺼내 그 위에 새 슬라이스를 놓습니다.
   참고: 섬판에 있는 두 개의 배경 보정 우물(A1 및 D6)에 뇌 절편을 배치하지 마십시오.
9. 분석을 실행하기 전에 온도와 pH 평형을 허용하기 위해 인큐베이터에서 37°C에서 최소 30분 동안 섬 플레이트를 배양합니다.

4. 원하는 화합물이 포함된 카트리지 로드

1. modified ACSF(37°C)에서 원하는 화합물을 포트 A에서 D까지의 작업 농도의 최종 재고 농도의 10x, 11x, 12x 및 13x로 각각 희석하고 pH 7.4로 조정합니다. 이 테스트는 포트 A에서 D까지 화합물을 순서대로 투여합니다. 이 실험을 위해, 10 mM 피루브산 (포트 A), 20 μM 올리고마이신(포트 B), 10 μM 또는 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP) (포트 C) 및 20 μM 안티마이신 A(포트 D)의 다른 농도와 함께 다음 용액을 사용하였다.
2. 75μL의 희석된 화합물을 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 사전 로드합니다. 팁을 주입 포트의 벽에 팁을 대고 45° 각도로 주입 포트의 중간에 놓습니다. 팁을 주입 포트 바닥에 완전히 삽입하면 포트를 통해 화합물이 누출될 수 있으므로 삽입해서는 안 됩니다.
3. 주입 포트가 균일하게 적재되었는지 육안으로 검사합니다. 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 상단에 잔류 방울이 없는지 확인합니다.
4. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 놓고 인큐베이터(non-CO₂)에 30분 동안 넣어 다시 37°C까지 가열할 수 있습니다. 유틸리티 플레이트만 잡고 조심스럽게 다루십시오. 가능한 한 적게 움직입니다.

5. 보정 및 분석 수행

1. 소프트웨어에 분석 템플릿을 로드합니다. 녹색 START 버튼을 누릅니다.
2. 올바른 프로토콜을 로드해야 합니다. 프로토콜에는 3분 믹스, 3분 대기 및 2분 측정 시퀀스의 조합이 포함되어 있습니다(이 세 단계는 하나의 측정을 형성합니다). 기기 설정의 하드웨어 설정에서 프로브 헤드의 거리를 26,600에서 27,800으로 변경합니다. XFe24 분석기의 프로브 헤드를 변경할 필요가 없습니다. 시작을 누릅니다.
3. 유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 기기 트레이에 로드합니다. 노치는 전면 왼쪽 모서리에 있습니다. 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하십시오. 보정을 위해 약물이 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드합니다.
4. 화면의 지시에 따라 센서를 보정하고 평형을 이룹니다. 약 30분 정도 걸립니다.
5. 보정 단계가 완료되면 보정 플레이트를 제거하고 (메쉬 및 조직 슬라이스 포함) 섬 플레이트로 교체합니다.
6. 분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소비량을 측정합니다. 프로토콜에는 3분 혼합, 3분 대기 및 2분 측정 시퀀스(이 세 단계는 하나의 측정을 형성함)의 조합이 포함되어 있으며, 이 시점에서 산소 소비율(OCR)이 계산됩니다.
7. 전체 실험에 대해 기준선을 만들기 위해 4x OCR 측정을 포함하고, 4x 측정으로 포트 A(피루브산염)를 주입한 다음, 8x 측정으로 포트 B(올리고마이신)를 주입하고, 5x 측정으로 포트 C(FCCP)를 주입하고, 마지막으로 6x 측정으로 포트 D(안티마이신 A)를 주입합니다.
   참고: 각 화합물 주입 후 이 측정 횟수는 측정이 고원에 도달하는 시점에 따라 결정됩니다.
8. OCR 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석합니다.

결과

그림 1: 세포외 플럭스 분석기 수화물 카트리지 센서 및 플레이트를 보여주는 이미지. (A) 보정 플레이트(유틸리티 플레이트) 위에 있는 센서 카트리지. (B) 측면 view 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지 플레이트의 모습. 유틸리티 및 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Accumet AB150 pH 탁상용 미터	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	pH를 측정하려면
Antimycin A from 스트렙토마이세스 sp.	SIGMA	A8674	미토콘드리아의 복합체 III을 억제하려면
소 혈청 알부민(BSA)	SIGMA	A6003	변형된 인공 뇌척수액(BSA-ACSF)을 만들려면
카르보닐 시안화물 4-( trifluoromethoxy) 페닐히드라존(FCCP)	SIGMA	C2920	미토콘드리아 호흡을 분리하려면
D-Glucose	SIGMA	G8270	인공 뇌척수액(ACSF)을 만들려면
DMSO	SIGMA	D8418	화합물을 dissovle<
HEPES	SIGMA	H3375	인공 뇌척수액(ACSF)을 만들려면
Humidified non-carbon dioxide incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	37°C에서 플레이트에 수분을 공급하려면
Streptomyces diastatochromogenes의 올리고마이신	SIGMA	O4876	미토콘드리아 ATP synthase를 억제하려면
파라필름	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF 세포외 플럭스 분석기	Seahorse Bioscience		산소 소비율 분석에 사용되는 장비, old generation<
해마 XFe24 세포 외 플럭스 분석기	Seahorse Bioscience		산소 소비율 분석에 사용되는 장비, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	플럭스 분석기 센서 카트리지, 조직 배양 플레이트, 캡처 스크린, 캘리브런트 용액 및 보정 플레이트 패키지; 분석 키트.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	기판 공급의 기판 제한 제약 조건을 방지하기 위해
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