엘라스타아제 처리된 혈관 파우치를 사용한 토끼의 실험적 동맥류 모델 개발

초록

출처: Wanderer, S., et al. 동맥 주머니 : 토끼의 미세 수술 분기 동맥류 모델. J. Vis. Exp. (2020)

이 영상은 엘라스타아제 처리된 혈관 주머니를 사용하여 토끼에서 실험적 동맥류 모델을 만드는 방법을 보여줍니다. 오른쪽 CCA의 일부를 절제한 후 파우치에 엘라스타아제를 투여한 다음 왼쪽 CCA를 봉합하여 혈류를 회복시킵니다. 그 결과 약해진 주머니 벽에 가해지는 스트레스는 동맥류 형성을 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 모든 동물을 섭씨 22°C의 실내 온도에서 수용하고 12시간(h)의 명암 주기를 유지합니다. 매번 물, 펠릿 및 ad libitum 건초 식단에 대한 무료 접근을 제공합니다. 통계 분석은 비모수 Wilcoxon-Mann-Whitney-U 검정을 사용하여 수행되었습니다. 0.05≤ 확률 값(p)은 유의한 것으로 간주되었습니다.

1. Presurgical phase

1. 23 ± 3 °C의 온도를 유지하면서 조용한 무균 수술실 바로 옆에서 수술 예정인 모든 토끼에 대한 자세한 수술 전 임상 검사를 수행합니다.
   1. 각 동물의 체중을 거시적으로 기록하고 점막, 모세혈관 보충 시간 및 맥박 품질을 평가합니다.
   2. 더 나아가 청진기와 복부 촉진으로 심장 청진을 수행합니다.
   3. 임상 결과를 바탕으로 각 토끼에 대해 American Society of Anesthesiologists(ASA)의 분류를 따릅니다19. ASA I 점수를 받은 동물만 연구에 포함합니다.
   4. 전기 면도기로 양쪽 귀를 면도하고 양쪽 이동맥과 정맥에 프릴로카인-리도카인 크림을 바릅니다.
2. 케타민 20mg/kg, 덱스메데토미딘 100mg/kg, 메타돈 0.3mg/kg을 주사기를 통해 피하주사(SC)
로 토끼를 진정시킵니다.
3. 각 동물을 최소 15분 동안 방해받지 않게 두십시오.
4. 그 후, 헐렁한 안면 마스크를 통해 3리터(l)/분(분)으로 보충 산소를 공급하고 맥박 산소 측정기를 통해 꾸준히 모니터링한 후 왼쪽 귀 중심 동맥에 22G 캐뉼라를 배치하고 반대쪽 귀의 귀 정맥에 또 다른 22G 캐뉼라를 배치합니다.
5. 수술 부위(목)를 면도하고 0.75% 절개 주위 로피바카인을 피내에 주입합니다. 다음으로, 이마를 면도하고 소아 뇌파검사(EEG) 센서를 배치할 준비를 합니다.
6. 프로포폴 1-2mg/kg으로 전신 마취를 유도합니다(IV). 그런 다음 즉시 카프노그래피 제어 하에 있는 실리콘 튜브(내경 3mm)로 모든 토끼의 기관을 삽관합니다. 그 후, 모든 토끼를 수술실로 이송하여 등쪽 누운 자세로 눕힌 다음 튜브를 소아과 서클 시스템에 연결합니다.
7. 1.3%의 최대 호기말 이소플루란 농도를 목표로 산소에서 이소플루란을 통해 마취 심화 및 유지 관리를 달성합니다.
8. 기관 발관까지 임상 및 기기 모니터링(맥박 산소 측정, 도플러 및 침습성 혈압, 3리드 심전도, EEG, 직장 온도 모니터링, 흡입 및 내쉬 가스)을 보장합니다.
9. 수분 유지를 위해 Ringer의 젖산은 정맥 접근을 통해 5ml/kg/h의 연속 속도 주입(CRI)으로 제공됩니다. 항상 10분 간격으로 발가락 꼬집음을 사용하여 적절한 마취를 확인하십시오.
10. 포비돈 요오드를 사용하여 manubrium sterni에서 양쪽 턱 각도까지 수술 부위를 소독합니다. 이제 수술 부위의 멸균 드레이핑을 수행합니다.
11. 수술 중 CRI가 50μg(μg)/kg/min인 리도카인과 3μg/kg/h의 펜타닐을 진통제로 투여합니다. 자발적 또는 보조 인공호흡과 허용적 고탄산산증을 적용합니다. 수술 중 최소 한 번 이상 동맥혈 가스 분석을 수행합니다.
12. 관련 저혈압(평균 동맥압 < 60mmHg)을 노르아드레날린으로 치료합니다. 발열 패드 또는 난방 강제 공기 가온 시스템을 사용하여 저체온증(직장 온도 ≤ 38°C)을 예방합니다.

2. 수술 단계 – Step I

1. manubrium sterni에서 턱 각도/후두 수준까지 정중 피부 절개로 수술을 시작합니다. 메스와 수술용 가위, 겸자로 피부와 연조직을 날카롭게 절개합니다. 뭉툭한 절개로 피하와 지방 패드를 내측으로 분리합니다.
2. 마이크로 집게와 수술용 가위를 사용하여 둔기로 왼쪽 흉쇄유돌근의 전방 상부 융기를 중앙으로 입력합니다.
3. 거시적으로, 마이크로 집게와 수술용 가위를 사용하여 후두 마비를 피하기 위해 둔기 준비를 수행하고 왼쪽 CCA를 원위부에서 조심스럽게 분리합니다(그림 1). 좌측 CCA의 분기점은 수술 중 랜드마크 역할을 합니다(그림 2 및 그림 3A). 다음 모든 단계에서 연조직 스프레더를 사용하여 수술 시각화를 개선합니다.
4. 미주신경에서 좌측 원위 CCA를 성공적으로 준비하고 해방시킨 후 파파베린(40mg/ml, 0.9% 등장성 염화나트륨 용액에 1:1 희석)을 국부적으로 투여합니다. 모든 혈관 부분을 마이크로 면봉으로 지속적으로 보호한 다음 외부에서 파파베린을 추가로 투여합니다. 파파베린에 적신 왼쪽 CCA를 자가 근육 조직 아래에 놓아 수술 현미경의 빛 아래에서 혈관이 건조되지 않도록 보호합니다.
5. 수술 중 외과의의 편안함을 극대화하면서 측면을 전환합니다. 오른쪽에서도 동일한 수술 절차를 반복합니다. CCA를 미리 정의된 랜드마크(턱 각도/후두 및 내부 경정맥 수준에서의 경동맥 분기; 그림 3A,B). 스프레더를 다시 삽입하고 앞에서 설명한 대로 마이크로 면봉과 파파베린을 투여합니다.
6. 우측 근위 CCA의 결찰 전에 정맥 귀 카테터를 통해 헤파린(500 국제 단위(IU)/kg)을 전신적으로 주입합니다.
7. 지금부터 수술용 현미경을 사용하십시오. 먼저, 동맥 혈관의 긴장을 피하기 위해 거시적으로 보이는 근위 경계표 바로 끝에 4-0 비흡수성 봉합사로 오른쪽 근위 CCA를 결찰합니다.
   1. 둘째, 첫 번째 4-0 결찰에서 원위부로 절단한 후 생성된 동맥낭이 모든 동물에서 약 3\u20124mm의 표준화된 길이가 된다는 점을 고려하여 측정을 위해 혈관 클립을 사용하여 정확히 4-0 비흡수성 합자를 원위부로 4\u20125mm로 적용합니다(그림 4A,C).
8. 6-0 합자를 조인 후 임시 혈관 클립(뇌동맥류 수술에 일반적으로 사용됨)으로 오른쪽 CCA를 가능한 한 원위적으로 고정하여 내피 손상을 방지하고 혈전 형성을 방지하기 위해 관개를 위한 긴 혈관 세그먼트를 만듭니다(그림 4B).
9. 이제 4-0 비흡수성 합자로 원위부로 절단합니다. 동맥낭을 적출하려면(그림 4C) 6-0 비흡수성 결찰에 대해 원위부로 두 번째 절단을 수행합니다.
10. 모든 연조직에서 동맥 주머니를 꼼꼼하게 청소하고 혈관 클립으로 길이, 너비 및 깊이를 측정합니다(그림 4C). 더 이상의 수정이 필요하지 않은 경우, 자가 동맥 이식편을 헤파린 처리된 용액(0.9% 염화등장성 나트륨 중 500 IU/100 ml)에 넣어 실온에서 계속 사용할 때까지 보관하십시오.

3. 동맥 주머니 분해

1. 동맥 주머니 분해가 필요한 경우 연조직을 꼼꼼하게 세척하고 실험 당일 실온에서 Tris-buffer 5ml에 용해된 돼지 엘라스타제 100IU로 사전 배양합니다. 브러시 기술을 사용하지 마십시오. 셰이커를 사용하여 동맥 주머니를 발광 내부 및 발광 외로 배양합니다.
2. 0.9% isotonic sodium chloride의 heparinized 용액에 파우치를 넣기 전에 0.9% isotonic sodium chloride 용액에 해부학적 집게로 3분 동안 부드럽게 세 번 문질러 남은 돼지 엘라스타제를 씻어냅니다.
3. 필요하다면, 실리콘으로 만든 마이크로튜브로 동맥 주머니의 내강을 열어 두십시오; 젖은 마이크로 패딩으로 전체 수술 과정 동안 왼쪽과 오른쪽 CCA를 꼼꼼하게 보호하십시오.

4. 수술 단계 – 단계 II

1. CCA의 추가 준비를 위해 동맥을 더 피상적으로 움직이기 위해 바로 아래에 두 개의 둥근 마이크로 면봉을 놓습니다. 이제 동맥을 더 잘 시각화하기 위해 왼쪽 CCA 아래에 보라색 패딩이 있는 마이크로 면봉 하나를 놓습니다.
2. 0.9% isotonic sodium chloride 100ml에 용해된 500IU의 헤파린을 결합한 0.9% isotonic sodium chloride 용액으로 오른쪽 근위 CCA를 플러시합니다. 긴장 없는 문합을 만들기 위해 수술 가위를 사용하여 왼쪽으로 터널을 뚫어 지방 패드/기관 주위 근육 조직 아래에 오른쪽 CCA를 놓습니다. 동맥의 연조직을 제거합니다.
   1. 이제 마이크로 가위와 집게를 사용하여 오른쪽 CCA의 근위부에서 2mm 물고기 입 절개를 수행합니다.
3. 수술대의 측면을 변경합니다. 왼쪽 원위 CCA를 다른 임시 혈관 클립으로 클립한 다음 두 개의 임시 혈관 클립으로 근위 왼쪽 CCA를 클립합니다. 젖은 마이크로 면봉을 사용하여 노출된 모든 혈관 부분이 수술 조명 아래에서 건조되지 않도록 보호합니다.
4. 왼쪽 CCA의 원위 3분의 1을 연조직에서 완전히 해방시키고 동맥 절개술을 수행합니다. 수술용 마이크로펜셉스를 사용하여 연조직을 부드럽게 잡습니다. 이제 동맥을 들어 올리고 수술용 마이크로 시저로 왼쪽 원위 CCA를 천천히 절개합니다. 혈관 세그먼트를 헤파린(0.9% 등장성 염화나트륨 용액 100ml에 용해된 500IU)으로 세척합니다.
5. 구부러진 마이크로 집게와 마이크로 가위로 동맥 절개술을 시행한 후, 경동맥의 오른쪽 둔기 직경과 자가 이식편의 약 2배를 측정하여 왼쪽 CCA의 원위 3분의 1에 위치한 동맥 절개술을 확대합니다. 이렇게 하면 동맥낭으로 충분한 혈류가 들어갈 수 있습니다.
6. 헤파린 식염수에서 동맥 주머니를 꺼냅니다. 분기가 계획된 수술 부위에 파우치를 놓습니다. 비흡수성 9-0 봉합사로 꼬리 방향에 위치한 오른쪽 경동맥 둔기의 뒤쪽을 봉합하기 시작한 다음, 생선 입 절개 부위 높이의 두개골 뒤쪽을 봉합합니다. 한 바늘로 원위에서 근위부로 뒤쪽을 재봉합니다.
7. 봉합하는 동안 모든 엘라스타제 사전 배양 파우치를 지속적인 관개로 촉촉하게 유지하십시오. 파우치의 혈관 벽을 봉합하는 동안 곡선형 수술용 마이크로 집게를 사용하여 끝으로 내강을 부드럽게 엽니다. 왼쪽 또는 근위 오른쪽 CCA의 일부를 봉합할 때마다 직선 수술용 마이크로 집게를 사용하십시오. 그 후, 수평 뒷면을 봉합합니다.
8. 다음으로 동맥류의 돔에서 시작하여 바닥으로 이동하는 수평 앞면을 봉합합니다. 그 후, 앞면의 원위부에 단일 스티치부터 시작하여 꼬리 방향으로 움직입니다.
   1. 문합을 봉합하는 동안 문합을 하는 동안 의원성 협착증을 피하기 위해 동맥 절개술에 가까운 혈관 부분을 잡는 것만으로도 주의하십시오. 또한 전체 수술 절차 동안 헤파린화된 염화나트륨 용액(0.9% 염화등장성 나트륨 100ml에 용해된 500IU)으로 채워진 주사기로 모든 혈관 부분을 광외로 지속적으로 적시고 젖은 마이크로 면봉으로 보호합니다.
   2. 문합을 완료하기 전에 전체 복합체에 heparinized 0.9% isotonic sodium chloride 용액 intraluminal(0.9% isotonic sodium chloride 100ml에 용해된 500IU)으로 관개합니다. 엘라스타제 변형 동맥 주머니는 건조하고 혈전증이 심하게 일어나기 때문에 가능한 한 빨리 꿰매어야 합니다. 주머니 내 잔류 엘라스타제 농도가 원주 혈관 소화와 관련하여 공격적인 행동을 하기 때문에 혈관 복합체를 빠르게 재관류하기 위해 수술을 빠르게 진행
해야 합니다.
9. 모든 임시 혈관 클램프를 단계적으로 제거합니다.
   1. 왼쪽 CCA에서 말단 클램프를 제거합니다. 경미한 출혈을 받아들이고 문합에 마이크로 면봉을 부드럽게 각인하여 단단히 고정합니다. 그런 다음 cl을 제거합니다.amp 오른쪽 CCA의 경우 마이크로 면봉과 집게로 부드럽게 눌러 혈전 형성을 방지합니다.
   2. 필요한 경우 임시 혈관 클립을 교체하여 충분한 응고를 제공합니다. 그런 다음 왼쪽에서 두 혈관 클립을 근방으로 분리합니다. 어떤 단계에서든 필요한 경우 응고를 허용하거나 다시 스티치를 수행할 수 있도록 클립을 교체하십시오.
10. 이 단계에서 혈관 복합체의 형광 혈관 조영술을 수행합니다(그림 5)
    참고: 형광 혈관 조영술은 2개의 대역통과 필터, 비디오 카메라가 있는 스마트폰 및 자전거 스포트라이트를 사용하여 1ml의 fluorescein IV를 투여하여 수행됩니다. 이 절차는 이미 다른 곳에서 설명되었습니다 20, 21, 22.
11. 마지막으로 작동 위치를 닫습니다. 문합을 보호하기 위해 단일 노드가 있는 3-0 흡수성 봉합사로 지방 패드를 다시 적응하고 부드럽게 봉합합니다. 같은 방식으로 피하와 피부를 닫습니다.

5. Postsur phase

1. 수술 종료 시 이소플루란 및 전신 진통제 투여를 중단하고 삼킴 반사가 돌아오는 즉시 기관 발관을 제공합니다.
2. 토끼가 자발적으로 흉골 리운지를 회복할 때까지 보충적인 산소공급과 적극적인 온난화를 제공하십시오.
3. 설치류와 토끼의 통증 평가 및 관리에 대한 지침에 따라 처음 3일 동안 하루에 4번 수술 후 후속 조치 및 동물 관리를 수행합니다23,24.
4. 통증 평가를 위한 점수표에 따라 외이에 펜타닐 패치(12μg/h)를 바르고, 3일 동안 하루에 한 번 SC 멜록시캠을, 구조 요법 SC로 메타돈을 투여하여 수술 후 진통제를 투여합니다. 모든 토끼에게 250IU/kg 저분자 헤파린(LMH)을 3일 동안 피하주사합니다.

결과

그림 1: 초기 작동 단계.

왼쪽 경동맥(흰색 화살표), 미주신경(검은색 화살표)(A) 및 후두 마비를 피하기 위해 왼쪽 경동맥과 미주 신경을 원위에서 조심스럽게 분리하는 초기 수술 단계.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G <
B. Braun, Germany	G0762563 <
B. Braun, 독일	C0766070
9-0 비흡수성 봉합	B. Braun, 독일	G1111140
아드레날린	아미노 AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	모든 제네릭
마취기	Dräger		any other
아스피린	사노피-아벤티스(스위스) SA	622693	any generic
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	any generic
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
양극 집게			any other
bicycle spotlight			any other
Biemer vessel clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, 스위스	FD560R	임시
바이스펙트럼 인덱스 (신생아)			기타
혈압 커프 (신생아)			< 기타
GlaxoSmithKline AG	758808	일반
Dexmedetomidine	Ever Pharma	136740-1	any generic
Electrocardiogram electrodes			any other
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	모든 일반
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	any generic
Fentanyl (정맥 사용)	Janssen-Cilag AG<	any generic
Fentanyl (transdermal)	Mepha Pharma AG	4008286	any generic
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	any generic
Glyco			any generic
Heating pad			any other
이소토닉 염화나트륨 용액 (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Ketamine	Pfizer	342261	any generic
Laboratory shaker	Stuart	SRT6	any other
리도카인	Streuli Pharma AG	747466	any generic
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	모든 일반
Microtubes			any other
마이크로 니들 홀더			any other
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	any generic
니들 홀더			any other
O2-Face mask			any other
Operation	microscope Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocaine-lidocaine crème	Emla		any generic
Propofol	B. Braun Medical AG, Switzerland		any generic
Pulse oxymeter			any generic
직장 온도 프로브(신생아)			any other
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	any generic
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
작은 동물 면도기			any other
스마트폰			any other
연조직 겸자			any other
soft tissue spreader			any other
스테인리스 스틸 스폰지 그릇			any other
멸균 마이크로 면봉			any other
청진기			any other
직선 및 곡선 마이크로 집게			any other
직선 및 곡선 마이크로 가위			any other
직선 및 곡선 겸자			any other
수술 드레이프			any other
surgical scissors			any other
주사기 1 ml, 2 ml 및 5 ml			any other
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	any generic
혈관 클립 어플리케이터	B. Braun, 독일	FT495T
정맥 및 동맥 카테터 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	일시적인

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