뇌암 세포 침입의 임피던스 기반 측정

초록

출처: Mudduluru, G., et. al. 암세포 이동 및 침입의 임피던스 기반 실시간 측정. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 교모세포종 세포 침입 및 이동을 측정하기 위한 임피던스 기반 분석을 보여줍니다. 세포는 세포외 기질을 분해하고, 미세 다공성 막을 통해 이동하며, 전극에 부착하여 임피던스를 생성합니다. 이 실시간 분석은 암 연구 응용 분야에 대한 침습적 잠재력을 반영합니다.

프로토콜

1. 실시간 세포 분석 시스템, CIM(Cell Invasion and Migration) 플레이트 및 도금을 위한 전기천공된 U-118MG 세포 준비

1. CO style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂ 배양 조건에 맞게 시스템을 안정화하기 위해 실험 시작 5-6시간 전에 배양 조건에서 인큐베이터
.
2. 침습 분석의 경우, CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에서 0.1μg/μL의 세포외 기질(ECM) 겔을 포함하는 DMEM(일반 배지) 플레이트 50μL. 기포가 생기지 않도록 하려면 역 피펫팅 방법을 사용하십시오. 즉시 30μL의 ECM 겔을 제거하고 웰에 20μL를 남겨둡니다.
3. ECM 젤 코팅 후 뚜껑을 씌운 상태에서 4시간 동안 배양 조건에서 인큐베이터의 플레이트를 보관하십시오. ECM 젤 코팅 및 건조 중에는 플레이트의 상부 챔버의 전극이 손, 생물 안전 캐비닛의 표면 또는 CO₂ 인큐베이터.
4. 임피던스 측정 프로그램을 설정하려면 관련 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하십시오(참조 Table of Materials)을 눌러 시스템 소프트웨어 응용 프로그램(제어 장치)을 엽니다. 각 크래들에는 실험 조건, 임피던스 측정 시간, 간격 및 지속 시간, 데이터 분석을 설정할 수 있는 서로 다른 탭이 있는 개별 창이 있습니다.
5. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Layout 탭에서 각 생물학적 조건에 대한 4중 웰을 설정하고 Schedule 탭을 클릭합니다. 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 1회 스윕)을 위한 것이고, 두 번째 단계는 실제 실험을 위해 각 개별 크래들에서 셀 임피던스를 측정하는 것입니다. 마이그레이션의 경우 각 개별 크래들에서 10분 간격으로 145개의 스윕을 사용하고, 침략의 경우 10분 간격으로 577개의 스윕을 사용합니다.
6. 세포 임피던스 측정 시작 1시간 전에 10% FBS가 포함된 160μL의 DMEM을 화학유인제로 플레이트의 하부 챔버 웰에 첨가합니다. ECM 겔 코팅된 웰이 들어 있는 상부 챔버 또는 코팅되지 않은 웰을 하부 챔버와 조립하여 각각 침입과 이동을 측정합니다.
7. 상부 챔버의 웰에 50μL의 저혈청 배지를 채우고 시스템의 요람에 놓습니다. Message 탭을 클릭합니다. 메시지가 OK로 표시되면 크래들의 플레이트가 실험할 준비가 된 것입니다.
8. 실시간 세포 분석 시스템 크래들에서 측정하기 전에 배양 조건에서 1시간 동안 인큐베이터에 완전히 충전된 플레이트를 사전 배양하며, 이는 충전된 플레이트를 세포 배양 조건에 적응하는 데 필수적입니다.
9. 저혈청 매체로 처리된 세포 수확의 경우 1x PBS로 배양 접시에서 자라는 세포를 세척하고 0.05% 트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 2mL를 추가합니다. 인큐베이터에 30초 동안 넣고 트립신-EDTA를 제거합니다. low serum medium 그리고 셀 수를 셉니다. 휴대용 자동 셀 카운터 사용.
10. 계산 후 100 x g고 상등액을 버립니다.
11. 이동 및 침입 분석을 위해 800μL의 저혈청 배지에 800,000개의 세포를 재현탁합니다. 또한 2mL의 배양 배지에 300,000개의 세포를 재현탁시키고 웨스턴 블롯 분석을 위해 35mm 접시에 시드를 삽입하여 Crk 및 CrkL의 조절된 녹다운을 확인합니다.

2. baseline 읽기, 세포 시딩, 세포 임피던스 측정 및 시각화

1. 크래들을 클릭하여 기준선 판독값을 측정합니다. Start 버튼. 기준선은 이산화탄소 인큐베이터의 배양 조건에서 실시간 세포 분석 시스템의 크래들에서 플레이트를 1시간 동안 사전 배양한 후 상부 챔버의 각 웰에 세포를 파종하기 전에 판독해야 합니다.
   참고: 일단 요람Start 버튼을 클릭하면 제어 장치에서 실험 파일을 저장할지 여부를 묻습니다. 파일이 저장된 후 크래들 분석기는 처음에 프로그램에 설정된 대로 기준선 셀 임피던스를 측정하고 크래들이 Start까지 일시 중지 모드로 들어갑니다. 버튼을 다시 클릭하여 두 번째 단계에서 셀 임피던스를 측정합니다.
2. 기준선 측정 후 요람에서 이동 및 침입을 위해 두 플레이트를 모두 꺼내 생물 안전 캐비닛에 보관하십시오.
3. 100 μL의 세포(100,000개 세포)를 기포를 피하기 위해 역 피펫팅을 통해 크래들의 제어 장치에 프로그래밍된 대로 각 웰의 CIM 플레이트의 상부 챔버에서 각 생물학적 조건에 대해 4배로 시딩합니다.
4. 파종 후에는 세포가 바닥까지 고르게 정착할 수 있도록 실온에서 30분 동안 플레이트를 생물 안전 캐비닛 아래에 보관하십시오. 플레이트를 해당 크래들로 다시 옮기고 크래들 시작 버튼을 클릭하여 1.5의 두 번째 단계에서 프로그래밍된 대로 셀 임피던스 측정을 시작합니다.
5. 마지막 스윕 후 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.
6. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Data Analysis 탭에서 실험 중 또는 완료 후에 시간에 따른 방식으로 세포 임피던스의 변화를 세포 인덱스로 시각화합니다. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Options를 클릭하여 각 사중주의 조건을 개별적으로 시각화하거나 평균 및/또는 표준 편차로 시각화할 수 있습니다. 상자.
7. 셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 빈 스프레드시트 파일을 열고 커서를 Data Analysis 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다. 나타나는 대화 상자에서 옵션을 선택합니다 Copy Data into List Format 열고 열려 있는 스프레드시트에 데이터를 붙여넣습니다.
8. 셀 임피던스 측정의 실제 시작 시간을 나타내도록 원시 데이터의 시간을 조정합니다. 두 번째 단계의 시작 시간은 0으로 설정됩니다.
   참고: 제어 장치에는 정규화 유무에 관계없이 셀 인덱스(즉, 정규화된 셀 인덱스)를 얻고 결과를 시간 종속 방식으로 그래픽 표시로 시각화할 수 있는 옵션이 있습니다. 이 예에서는 셀 인덱스 데이터를 처리 및 그래픽 표시를 위해 정규화 없이 내보냅니다.
9. 각 크래들에 있는 Release 버튼을 클릭합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 시리즈 Class II, Type A2
CIM plates	Agilent Technologies, Inc.의 세포 분석 부서	5665825001	세포 침입 및 이동 plates
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	302002	세포에 사용되는 배양 배지 culture
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	Gibco	21-031-CV	세포를
태아 소 혈청(FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i 이산화탄소 인큐베이터	ThermoFisher Scientific	51030285	carbon dioxide incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
RTCA software	세포 분석 부서 Agilent Technologies, Inc		실험에
Scepter	Millipore	C85360	휴대용 자동 세포 카운터
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	실험
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc<

세척하는 데 사용되는 DPBS 사용되는 기기에 사용된 세포주td style='너비:145pt;'>380601050