인간 시냅토솜을 이용한 미세아교세포 유사 세포의 생세포 식세포작용 분석

초록

출처: Funes, S., et. al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes(인간 시냅토솜을 사용한 유도 만능 줄기세포 및 체외 생세포 식세포작용 분석의 분화). J. Vis. Exp. (2022)

이 비디오는 pH에 민감한 형광 염료 표지 시냅토솜을 사용하여 미세아교세포와 같은 세포의 식세포 능력을 연구하는 분석을 보여줍니다.

프로토콜

1. Live-cell phagocytosis assay
   1. Plate 20-30 × 100 μL의 iMG complete medium에서 96-well plates로 넣고 10일 동안 분화 과정을 따릅니다.
   2. 분석 당일, 2mL의 iMG 기저 배지에 살아있는 세포에 대한 핵 염색 1방울을 추가하여 핵 염색 용액을 준비합니다.
   3. 라벨이 붙은 시냅토솜을 얼음 위에서 해동하고 물 초음파 처리기를 사용하여 1분 동안 부드럽게 초음파 처리합니다. 즉시 시냅토솜을 얼음으로 다시 옮깁니다. 표지된 시냅토솜을 iMG 완전 배지에서 배지 50μL당 1μL의 시냅토솜 비율로 희석합니다.
      참고: 시냅토솜의 농도는 분석에 따라 달라지며 최적화가 필요할 수 있습니다. 배지에서 DMSO의 상대적으로 낮은 비율(즉, 0.1% 이하)을 유지하기 위해, 웰당 2μL 이상의 시냅토솜을 첨가하지 않는 것이 좋다.
   4. negative control로서, 액틴 중합을 억제하기 위해 cytochalasin D로 일부 웰을 전처리하여 phagocytosis를 억제합니다. iMG 완전 배지에서 60μM 사이토칼라신 D 용액을 준비합니다. 이 용액 10μL를 각 웰에 추가하여 최종 농도 10μM를 만들고 37°C 및 5% CO₂에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10°C에서 10분 동안 인큐베이트합니다. 플레이트를 얼음 위에 유지하고 시냅토솜을 포함하는 배지 50μL를 추가합니다.
   6. 10°C에서 3분 동안 270×g의 플레이트를 원심분리하고 이미징 획득까지 플레이트를 얼음 위에 유지합니다.
2. Imaging acquisition and analysis
   1. 플레이트를 라이브 셀 이미징 리더에 삽입하고 분석할 웰을 선택합니다.
   2. 20x 대물렌즈를 선택합니다.
   3. 명시야 및 청색(4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) 채널의 초점, 발광 다이오드(LED) 강도, 통합 시간 및 이득을 조정합니다. 시냅토솜 형광은 초기 시점에서 무시할 수 있어야 합니다. 명시야 채널을 참조로 사용하여 빨간색(RFP) 채널에 초점을 맞춥니다. 적분 시간과 게인은 실험마다 다를 수 있습니다. 빨간색 채널에 대해 LED: 4, 통합 시간: 250 및 게인: 5에 대한 초기 설정을 사용합니다.
   4. 우당 몽타주에서 획득할 개별 타일의 수를 선택합니다(예: 우물 중앙에서 16개의 타일을 획득하여 전체 우물 면적의 약 5%를 이미징). 온도를 37°C로 설정하고 이미징을 위해 원하는 시간 간격을 설정합니다.
      참고: 이 연구에서 최대 16시간 동안 1 - 2시간마다 이미지를 획득했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 재료
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
CellAttach Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Corresponding to laminin 521
Components: iMG base media<
고급 DMEM/F12	Gibco	12634010	최종 농도 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	최종 농도 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	최종 농도 1x
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	최종 농도 100 U/mL
IMG의 구성 요소 complete media
55 mM 2-메르캅토에탄	Gibco	21985023	최종 농도 55μM
IL-34	PeproTech 또는 Biologend	200-34 or 577904	최종 농도 100 ng/mL
iMG base media			최종 농도 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	최종 농도 5 ng/mL
tgg-β<	100-21	최종 농도 50 ng/mL
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	pH에 민감한 염료
기타 세포 배양 시약
Cytochalasin D	Sigma		최종 농도 10 μM
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 마이크로플레이트 리더 및 이미저 소프트웨어	Biotek	버전 3.03

td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> 올td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>PeproTech 참조