Western Blotting을 통한 Phosphorylated Neuronal Potassium-Chloride Cotransporter 2 검출

초록

출처: Josiah, S. S., et al. 웨스턴 블로팅을 이용한 Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2의 기능 및 활성에 관한 연구. J. Vis. 특급. (2022).

이 동영상은 세포 용해물에서 인산화된 염화칼륨 공동수송체 2(KCC2) 단백질을 검출하고 정량화하는 단계를 보여줍니다. 이 과정에는 인산화된 KCC2를 분리하기 위한 면역침전과 분리된 단백질을 정량화하기 위한 화학발광이 포함됩니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 transfection

1. 세포 배양 절차 전에 비드 수조(37°C)에서 모든 시약을 따뜻하게 합니다. 소 태아 혈청 10%, 2mM L-글루타민 각 1%, 비필수 아미노산 100mM, 피루브산 나트륨 100 및 페니실린-스트렙토마이신 100 units/mL가 보충된 배양 배지인 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 준비합니다.
2. 비드 배스(37°C)에서 쥐 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포(HEK293^rnKCC2b)를 안정적으로 해동합니다. cryovial tube의 세포를 5mL의 새로운 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1200 ×g에서 3-5분 동안 셀을 돌립니다.
3. 접시를 인큐베이터에 넣고 가습된 5% CO₂ 대기에서 37°C에서 48시간 동안 자라도록 합니다. 건강한 세포 성장을 보장하기 위해 잠복기를 모니터링합니다. 배양 기간 후 90% 이상의 합류점을 달성한 세포를 추가로 분할합니다.
4. 세포 접시에서 오래된 배지를 흡인하고 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 트립신 2mL를 넣고 실온에서 약 1-2분 동안 배양합니다.
5. 용해 완충액에서 세포를 수확하기 전에 15분 동안 디메틸설폭사이드(DMSO)를 대조군으로 사용하거나, 8μM 스타우로스포린을 사용하거나, 0.5mM N-에틸말레이미드(NEM)를 사용하여 세포를 처리합니다.

2. 세포 용해물 준비 및 샘플 로딩

1. 배양 접시의 배지를 흡인합니다(transfection 절차에서). 세포 배양액을 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻습니다.
2. PBS를 흡인시킨 다음 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 50mM 불화나트륨, 5mM 피로인산나트륨, 10mM 나트륨-β-글리세로포스페이트, 1mM 오르토바나데이트나트륨, 1%(w/v) 트리톤 X-100, 0.27 M 자당, 1 mM 벤자민, 0.1 % (v / v) 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 mM 페닐 메틸 설포 닐 플루오 라이드 (PMSF).
   참고: 세포 수확 중 용해 완충액의 부피는 접시 크기에 따라 다릅니다, 예를 들어, 1 x 10⁷ cells/100 mm dish/150 cm² flask당 1 mL의 lysis buffer가 적합하고, 0.5 mL는 5 x 10⁶ cells/60 mm dish/75 cm² flask 당 적합합니다.
3. 16,000 x g의 차가운 원심분리기(4°C)에서 세포를 20분 동안 회전시키고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상등액을 미리 냉각된 새 튜브에 모으고 펠릿을 버립니다.
   참고: 세포 유형에 따라 원심분리력과 시간을 변경해야 할 수도 있습니다. 그러나 일반적인 지침에서는 16,000 x g에서 20분 동안 원심분리를 권장합니다. 그러나 이는 모든 실험에 대해 결정해야 합니다. 예를 들어, 백혈구와 같은 섬세한 세포는 매우 가벼운 원심분리 속도가 필요합니다.

3. 세포 용해물에서 면역침전물질의 제조

1. 300 μL의 단백질-G-sepharose를 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 용액을 500 x g에서 2분 동안 회전시키고 상등액을 버립니다.
2. PBS 500μL를 추가하고 솔루션을 잘 와류로 만듭니다. 용액을 500 x g에서 2분 동안 회전시키고 상등액을 버립니다. 이 단계를 반복합니다.
3. 1mg의 anti-KCC2 Thr906 및 anti-KCC2 Thr1007 항체와 200μL의 단백질 G-sepharose 비드를 혼합하고 PBS로 500μL의 부피를 구성합니다. 진동 플랫폼이나 회전 휠에서 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다. PBS로 2번 세척합니다.
4. PBS의 200 μL로 immunoprecipitants (beads)를 3x 세척합니다. 최종 펠릿을 100μL의 1x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 버퍼에 재현탁합니다.
5. 실온의 로터 셰이커에서 튜브를 5분 동안 흔들고 75°C의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 11,000 x g에서 로딩 샘플을 2분 동안 원심분리하고 상등액을 겔 로딩에 사용합니다.

4. western blot

1. 주조 장치를 조립하고 갓 준비한 8% 분리 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 부어 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 허용하면서 젤을 주조합니다. 설정에 200μL의 앱솔루트 이소프로판올을 추가하고 60분 동안 실온에서 방치합니다.
   참고: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE)에 대한 폴리아크릴아미드 겔 레시피는 관심 단백질의 크기에 따라 다릅니다(표 2). 그러므로, 원한 젤 백분율을 결정하기 전에 단백질 크기를 기록해 두십시오.
2. 피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200μL의 증류수로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 갓 준비한 6% 스태킹 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 추가하여 주조 설정에서 약 2cm의 공간을 채웁니다. 웰 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
3. casted gel을 전기영동 탱크에 고정합니다.
4. 1000mL의 증류수에 Tris 염기 30.3g, 글리신 144.1g, SDS 10g을 용해하여 10x 전달 완충액을 준비합니다. 890mL의 증류수에 10mL의 10% SDS와 100mL의 10x 전달 버퍼를 첨가하여 1x 러닝 버퍼를 준비합니다.
5. 탱크에 러닝 버퍼를 1번 붓습니다. 5 μL의 분자량 마커를 첫 번째 웰에 로드하고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 겔의 각 웰에 동일한 양으로 로드합니다(사용된 빗 크기에 따라 18-30 μL 사이). 빈 웰을 1x LDS로 채우고 120V에서 약 90-120분 동안 젤을 실행합니다.
6. 58.2g의 트리스 염기와 29.3g의 글리신을 증류수 1000mL에 용해하여 10x 전달 완충액을 준비합니다. 20% 메탄올을 함유한 1x 전달 버퍼로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 활성화합니다. 전사 버퍼로 겔과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펴 바릅니다.
   참고: 필요한 최적의 pH에 있어야 하므로 실행 및 전송 버퍼의 pH를 조정할 필요가 없습니다. 또한 시간을 절약하기 위해 실험 전에 이러한 완충액을 준비하고 실온에서 보관하는 것이 좋습니다.
7. 순서로 샌드위치를 옮길 준비를 합니다: 음극(검은색 프레임/끝) - 샌드위치 폼 - 여과지 - 헹굼된 SDS-PAGE 젤 - 헹굼된 니트로셀룰로오스 멤브레인 - 여과지 - 샌드위치 폼 - 양극(빨간색 프레임). 조립된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90V 90분 동안 또는 30V 360분 동안 작동합니다.

5. 항체 염색 및 이미지 개발

1. 멤브레인을 제거하고 말리십시오. 0.1% 1x Tween 20(1x TBS-T)을 함유한 Tris-buffered saline에 5% 탈지유로 만든 차단 버퍼를 사용하여 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
2. 1차 항체^8,15,19 및 베타-액틴(로딩 제어)을 차단 버퍼에 적절하게 희석하여 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다. 멤브레인을 1x TBS-T를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
   참고: beta-actin, alpha-tubulin 또는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 항체와 같은 로딩 제어가 있는 별도의 멤브레인의 배양은 후속 정량화 중에 다른 웨스턴 블로팅 결과를 정규화하는 것입니다. 각 1차 항체에 대한 권장 희석액은 제조업체의 설명서에서 확인할 수 있습니다.
3. 세척된 멤브레인을 차단 버퍼에 5000배 희석한 2차 항체로 실온에서 60분 동안 배양합니다. 다시 말하지만, 멤브레인을 3x TBS-T에서 1x 5분 동안 세척합니다.
   참고: 1차 항체가 상승하는 종에 대해 2차 항체를 상승시키는 것이 좋습니다. 예를 들어, 총 KCC2의 1차 항체가 마우스 anti-KCC2인 경우 anti-mouse에 대한 2차 항체를 사용해야 합니다.
4. 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 각 Enhanced chemiluminescence(ECL) 시약을 동일한 부피로 혼합하고 혼합된 용액을 멤브레인에 부드럽게 펴서 신호를 발생시킵니다.

6. 이미징 시스템 및 데이터 정량화를 사용한 이미지 획득

1. 이미징을 위해 이미징 보드를 이미징 시스템의 적절한 구획으로 전송합니다. 이미지 처리를 위해 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니다.
2. 도구 모음에서 새 프로토콜을 클릭하고 단일 채널을 선택합니다. gel imaging/application(젤 이미징/응용 프로그램) 대화 상자에서 Select(선택)를 클릭하고 Blot(블롯)으로 스크롤한 다음 Chemi Hi Sensitivity(Chemi 고감도) 또는 Chemi Hi Resolution(Chemi 고해상도)을 선택합니다. 그런 다음 Signal Accumulation Setup을 클릭하여 획득할 이미지의 지속 시간과 수를 설정합니다.
3. protocol setup에서 Position Gel을 클릭하고 필요한 경우 이미징 시스템에서 gel을 조정합니다. Run Protocol(프로토콜 실행)을 클릭하여 이미지를 획득합니다.
4. 이미징 카탈로그 상자 아래에 있는 획득한 이미지 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지를 컴퓨터에 저장합니다. 원하는 이미지로 이동하고 실행 대화 상자에서 이미지 선택 및 계속을 클릭합니다.
5. 이미지 변환 아이콘을 클릭하여 이미지의 대비와 픽셀 채도를 조정합니다. 일반 도구 모음에서 스크린샷 아이콘을 클릭하여 원하는 이미지 형식에 따라 이미지를 컴퓨터에 저장합니다.
6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 측정하고 적절한 통계 도구를 사용하여 분석합니다.

결과

표 1: 폴리아크릴아미드 겔 믹스(겔 용액 분리 및 적층)를 만들기 위한 레시피.

8% 분리 젤 8mL

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
40% 아크릴아미드	Sigma-Aldrich	A2917	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용
황산암모늄	Sigma-Aldrich	248614	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Western blotting의 1차 항체로 사용
Dundee University	S700C	Western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	western blotting의 1차 항체로 사용
anti-KCC2 pThr1007	던디 대학교	S961C	웨스턴 블로팅
anti-KCC2 pThr906	던디 대학교	S959C	웨스턴 블로팅
anti-mouse	세포 신호 전달 기술	66002	western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	용해 버퍼
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	loading buffer 및 lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	용해물 단백질 정량화
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	용해물 준비
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	샘플 회전에 사용
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	세포 배양 실험
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	차단 버퍼를 만드는 데 사용
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - 고포도	Sigma-Aldrich	D6429	세포 배양
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	용해 버퍼
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	SDS-page 전기영동
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	멸균 장비 및 환경
Fetal Bovine Serum - heat inactivating	Merck Life Sciences UK	F9665	세포 배양
Fumehood	Walker	A7277	세포 배양
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	전사 샌드위치를 만들기 위해 웨스턴 블로팅에 사용됨
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers	GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA
Version 6.0	Western blotting에 대한 그래프 플로팅 및 데이터 분석에 사용됨
HCl	Acros Organics	10647282	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용	Heating block	Grant
QBT1	WB 로딩 샘플을
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	배양 실험
ImageJ Software	Wayne Rasband 및 기여자; 미국 NIH	ImageJ 1.53e	Western blotting image
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting
Incubator	LEEC	LEEC 정밀도 190D	세포 배양
Isopropanol	Honeywell	24137	전기영
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	세포 배양
리튬 도데실 설페이트(LDS)	Novex	NP0008	western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	세포에 사용 culture
microcentrifuge	Eppendorf	5418	WB
Microplate reader	BioRad	iMark	용해물 단백질 농도 판독에 사용
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Western blotting image
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	세포 배양 실험
니트로셀룰로오스 membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	세포 배양
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	완충 용액
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	세포 배양
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	western blotting의 1차 항체로 사용
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	면역침전에 사용	Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
세척 버퍼의 구성 요소로 사용
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653	TBS-T 버퍼
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	세포 배양
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	용해 버퍼
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	세포 배양 실험
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	용해 버퍼
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	membrane에서 단백질을 전달하기 위해 웨스턴 블로팅에 사용	Tris
Sigma-Aldrich	T6066	SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	용해 버퍼의 구성 요소로 사용	Trypsin-EDTA 솔루션
Merck Life Sciences UK	T4049	세포 배양
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	세포 배양
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	솔루션을 배양하는 데 사용됩니다.

anti-KCC2의 1차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 2차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 2차 항체로 사용의 2차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 1차 항체로 사용의 구성 요소로 사용의 구성 요소로 사용됨에 사용됨를 실행하는 데 사용에 사용됨에 사용당에 사용용 이미지 개발에 사용의 구성 요소로 사용의 구성 요소로 사용을 실행하기 위한 전원을 공급하려면 준비에 사용에 사용에 사용 가열하는 데 사용됨용 세포주에서 밴드 강도를 측정하는 데 사용됨 images에 사용동을 위한 주조 젤에 사용에 사용의 로딩 버퍼로 사용용 용해물을 준비하는 데 사용됩니다를 편집하는 데 사용됨에 사용에 사용의 pH를 모니터링하는 데 사용됨의 구성 요소로 사용에 사용를 준비하는 데 사용의 구성 요소로 사용에 사용의 구성 요소로 사용에 사용의 구성 요소로 사용에 사용에 사용됨 혼합에 사용