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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 망막 신경절 세포 소마의 정량화
참고: 다음 절차는 뇌 특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3A(Brn3a)에 대한 항체를 사용한 망막 편평 장착의 면역조직화학적 염색을 기반으로 망막 신경절세포종의 정량화를 위한 것입니다.
- 1mL의 1x PBS가 포함된 24웰 배양 플레이트(웰당 하나의 망막)로 분리된 망막을 옮기고 내부 망막이 위를 향하도록 합니다.
- 1x PBS(0.3mL)에 희석된 비이온성 계면활성제 0.5%로 3회 10분 동안 세척하여 조직을 투과합니다. 그런 다음 비이온성 계면활성제 2% 및 1x PBS(차단 용액, 0.25mL)의 5% 소 혈청 알부민(BSA)에서 실온에서 60분 동안 조직을 부드럽게 흔듭니다.
- 1.2단계에서 비이온성 계면활성제 0.5%와 1x PBS와 5% BSA를 1:200으로 희석하여 Brn3a 1차 항체 용액을 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- 조직 차단 60분 후 0.2mL의 1차 항체 용액에 있는 망막을 4°C에서 72시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
- 1x PBS로 조직을 10분 동안 3회 세척한 다음 1x PBS와 5% BSA에 1:750으로 희석된 2차 항체 용액 0.2mL에서 실온에서 2시간 동안 조직을 배양합니다.
- 또한, 형광 핵 염색을 위해 nuclear counterstain 용액에서 조직을 10분 동안 배양합니다. 1x PBS(0.3mL)를 3회 반복하여 최종 세척 단계로 면역조직화학을 마무리합니다.
- 두 개의 작은 브러시를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 망막을 전달하고 유리체 면이 위로 향하게 유지합니다. 등쪽 망막 사분면을 현미경 슬라이드에 배치합니다. 다른 3개의 사분면(비강, 복부 및 측두부)을 구분하기 위해 시신경 머리를 향해 방사형으로 두 번 더 절단합니다.
참고: 절단 치수는 고정되어 있지 않습니다. 슬라이드에서 망막을 효율적으로 평평하게 하는 데 방해가 될 정도로 너무 짧아서도 안 되며, 시신경 구멍에 도달하여 구분된 망막 사분면을 나머지 조직과 완전히 분리할 수 있도록 너무 길어서도 안 됩니다. - 마지막으로, 0.2mL의 퇴색 방지 마운팅 매체를 유리 커버슬립에 바르고 조직 현미경 분석을 위해 편평하게 장착된 망막에 놓습니다. 망막 신경절 세포의 밀도를 추정하려면 40x/1.3 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 상피 형광 현미경 아래에서 평면 마운트를 검사합니다.
- 망막의 각 사분면에 대해 중앙 망막에서 2장(시신경 디스크에서 ~0.9mm), 중간 망막에서 3장(시신경 디스크에서 ~2.0mm), 주변 망막에서 3장(시신경 디스크에서 ~3.7mm) 등 총 32장의 사진을 찍습니다. FIJI 소프트웨어를 사용하여 Brn3a 양성 세포를 계수하고 평균 세포 밀도를 추정합니다.