부정맥에 대한 감수성을 평가하기 위한 심장내 신경계의 자극

초록

출처: Jungen, C., et al. 생체 외 Langendorff 시스템에서 심장 전기생리학 및 부정맥 형성에 대한 심장 내 뉴런의 영향. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 심장내 신경계를 자극하여 부정맥에 대한 심장의 민감성을 평가하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 관류 장치를 사용하여 분리된 마우스 심장에 산소가 함유된 완충액을 관류합니다. 그런 다음 심장내 신경계는 부정맥을 유발하기 위해 고주파로 자극됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. Langendorff 장치의 준비

참고: 상업적으로 이용 가능한 Langendorff 관류 시스템이 사용됩니다.

1. 변형된 Krebs-Henseleit 용액(염화나트륨 119mM, 중탄산나트륨 25mM, 염화칼륨 4.6mM, 인산칼륨 일염기성 1.2mM, 황산마그네슘 1.1mM, 염화칼슘 2.5mM, 포도당 8.3mM 및 피루브산나트륨 2mM)을 준비합니다. 칼슘 침전을 방지하려면 관류 용액에 95% 산소/5% 이산화탄소의 혼합물을 첨가하십시오. 0.22μm의 기공 크기로 버퍼를 필터링합니다.
2. 버퍼에 약리학적 제제를 추가하여 필요에 따라 심장 전기 생리학 및 부정맥 형성에 미치는 영향을 조사합니다.
3. 수조를 시작하고 95% 산소/5% 이산화탄소의 혼합물을 포함한 관류 용액을 놓습니다. 캐뉼라 직전의 관류 용액 온도가 ~37 °C가 되도록 수조의 온도를 조정합니다.
4. 올바른 온도에 도달하는 즉시 롤러 펌프를 시동하고 장치에 관류 용액을 채웁니다.
5. 심장을 장치에 장착할 때 캐뉼라에 기포가 남지 않도록 심장을 부착하기 전에 펌프 속도를 조정하십시오.

2. 하드 및 소프트웨어 준비

1. 디지털 데이터 수집 시스템과 해당 소프트웨어를 Langendorff 장치에 연결하여 관류 압력, 유속 및 심박수를 지속적으로 기록합니다.
   1. 일반 설정에서 목표 관류 압력을 80mmHg로 설정합니다.
   2. 녹음을 시작합니다.
2. 지정된 디지털 자극 발생기를 사용한 데이터 기록 및 자극의 경우 백금 전극이 있는 전기생리학 카테터, 전극 표면이 0.5 x 0.5mm, 전극 간격이 0.5mm인 카테터를 사용합니다.
   1. 장치에 부착한 후 심장이 위치할 부위에 가깝게 카테터를 놓습니다.
   2. 위치 카테터에서 2개의 전극을 선택하여 자극을 준비하고 100ms의 사이클 길이를 사용합니다.

3. 심장의 준비

1. 2 페트리 접시 (지름 6cm 및 10cm)와 캐뉼라가있는 접시에 차가운 (~ 2-4 ° C) 관류 완충액 (10-20 mL 및 40-50 mL)을 추가합니다. 그리고 현미경 바로 옆과 아래의 얼음 위에 놓습니다. 캐뉼라 주위에 이중 매듭을 준비합니다.
2. 경추 탈구 후 Mayo 가위와 좁은 패턴 집게를 사용하여 흉부를 열어 심장을 빠르게 절제합니다. 그런 다음 런던 집게를 사용하여 횡격막 위의 대동맥과 대정맥을 잡고 사시 가위로 척추에 가까운 모든 혈관과 결합 조직을 절단하여 심폐 차단을 절제합니다.
3. 얼음처럼 차가운 완충액을 채운 첫 번째 접시(직경 6cm)에 심폐 차단을 옮기고 사시 가위와 런던 집게를 사용하여 심장을 손상시키지 않고 폐를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 심장을 현미경으로 놓고 스프링 가위와 Dumont SS 집게를 사용하여 흉선, 식도 및 기관을 조심스럽게 제거합니다.
4. 스프링 가위를 사용하여 카테터 삽입을 위해 우심방 상부에 1.5 - 2mm 구멍을 자릅니다. 폐동맥에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 대동맥상 가지 바로 아래에 있는 대동맥을 절단하고 조직을 제거하여 매듭이 쉽게 붙을 수 있도록 합니다.
5. 좌심방 주변의 주요 심방에 위치한 신경절 신경총을 포함한 심방 지방 패드를 그대로 유지하거나 조심스럽게 절개하여 완전히 제거합니다.
6. 캐뉼라가 있는 접시에 심장을 옮기고 현미경 아래에 놓습니다. Dumont SS 집게로 대동맥을 캐뉼라 위로 당기고 준비된 매듭을 대동맥 주위에 단단히 묶습니다. 캐뉼라가 대동맥에 너무 깊숙이 배치되지 않도록 하여 대동맥 판막과 관상 동맥 혈관이 자유롭게 유지되도록 합니다.
7. 캐뉼러를 Langendorff 장치에 빠르게 부착합니다. 캐뉼라에 거품이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
8. 관류 압력을 80mmHg로 전환하여 일정한 압력 관류를 허용합니다.
9. 심장을 건드리거나 손상시키지 않도록 카테터를 우심방과 우심실에 조심스럽게 삽입하고 테이프로 캐뉼라에 부착합니다.
10. 초기 20분 평형 기간 동안 준비된 100ms의 사이클 길이로 자극을 시작합니다.
11. 안정적인 온도를 유지하기 위해 챔버를 닫으십시오.

4. 전기생리학적 매개변수 및 부정맥 발생

1. {{}}다음 단계에 설명된 대로 심방 또는 심실 페이싱 임계값의 두 배에서 카테터의 원위 또는 근위 전극을 통해 프로그래밍된 자극을 적용하여 전기생리학적 매개변수를 평가합니다.
   1. 120ms, 100ms 및 80ms의 S1S1 주기 길이에서 고정 속도 페이싱의 10초 후 sinus node 복구 시간을 최대 복귀 주기 길이로 결정합니다.
   2. Wenckebach 점을 가장 긴 S1S1 주기 길이로 결정합니다(8 자극; S1S1: 100밀리초; 2ms 단계적 감소) 11AV 결절 전도의 손실. 방실 결절 불응 주기를 가장 긴 S1S2(12 자극; S1S1: 120ms, 110ms 및 100ms; AV 결절 전도의 손실과 함께 2ms 단계적 S1S2 감소를 동반한 하나의 짧은 결합 extrastimulus.
   3. 심방 및 심실 불응 주기를 가장 긴 S1S2(12 자극; S1S1: 120ms, 110ms 및 100ms; 2ms 단계적 S1S2 감소를 동반한 하나의 짧은 결합 외자극)은 심방 또는 심실 반응이 없습니다.
2. Lambeth Conventions에 따라 프로그래밍된 외자극(S1S1: 120ms, 100ms 및 80ms 후 최대 3회 추가 비트, 60 - 20ms, 2ms 단계적 감소) 또는 버스트 페이싱 프로토콜(S1S1에서 5초: 50 - 10ms, 10ms 단계적 감소)을 수행하여 심실 부정맥 형성을 평가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S3014	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
염화칼	Sigma-Aldrich	P5405	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
인산칼륨 monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Carbogen (95% 산소 / 5% 이산화탄소)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany		Modified Krebs-Henleit solution
멸균 필터 steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	수정된 Krebs-Henleit 솔루션
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
카테터 및 생리학적 매개변수에 대한 데이터 수집 시스템 및 해당 소프트웨어	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff 설정
octapolar catheter	CIB'ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	사용자 정의	Langendorff 설정
Stimulus generator	STG4002, 다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany	STG4002-160μA	자극 설정
Stimulation software	다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	자극 설정
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, Neenah, WI, United		소모성 재료
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	심장 준비
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	심장 준비
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	심장 준비
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	심장 준비
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	심장 준비
좁은 패턴 집게	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	심장 준비

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