마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상 유도

초록

출처: Macheda, T., et. al. 마우스의 경미한 외상성 뇌 손상의 전자기 제어 폐쇄 머리 모델. J. Vis. Exp. (2022)

이 영상은 입체 프레임을 사용하여 마우스 모델에서 폐쇄 머리 부상을 유도하는 절차를 보여줍니다. 통제된 충격은 경미한 외상성 뇌 손상을 복제하여 연구원들은 부상 후 반사 신경과 행동을 측정하여 신경학적 영향과 회복을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 절차

1. 경량 아세탈 수지 테이퍼 포인트 이어바, 바이트 바 및 마우스 마취 마스크를 사용하여 마우스를 입체 프레임에 고정합니다(그림 1G, H 참조). 이소플루란 가스는 100-200mL/분의 실내 공기 중에서 2%-3%로 전달됩니다. 마우스의 호흡을 주의 깊게 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 가스 수준을 조정합니다.
2. 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 멸균 눈 윤활제를 눈에 바르십시오.
3. 포비돈 요오드 면봉과 멸균 알코올 패드로 두피를 3회 소독합니다.
4. 발가락 꼬집음 반응이 없는지 확인하여 마우스가 깊이 마취되었는지 확인합니다.
5. 메스를 사용하여 눈과 목 사이의 약 1cm 정중선 두피 절개를 만들어 두개골을 노출시킵니다(그림 1I 참조).
6. 두개골을 1-2분 동안 건조시킵니다.
7. 브레그마(bregma, 관상봉합사와 시상봉합선의 교차점)와 람다(lambda, 시상봉합사와 양봉합사(lambdoid 봉합선의 교차점)를 식별합니다(그림 그림 1J 참조).
   참고: 마우스 뇌 지도책을 참조용으로 사용할 수 있습니다.
8. 머리 지지 장치를 머리 아래에 놓고 전구가 마우스의 머리 아래쪽을 누르지만 바이트 바에서 머리를 들어 올리지 않을 때까지 전구에 물을 붓습니다.
   참고: 이 단계는 폐쇄두부 손상(CHI)으로 인해 발생할 수 있는 귀 문제를 줄이는 데 필수적입니다. 이어 바에서 귀가 손상되어 구르거나 출혈이 있는 동물은 연구에서 제외되고 안락사되어야 합니다.
9. 임팩터를 동물의 머리 위로 움직입니다.
10. 임팩터 컨트롤 박스에 있는 Extend/Retract 토글 스위치를 Extend에 배치하여 임팩터를 확장합니다.
    참고: 팁을 아래로 당겨 팁이 완전히 확장되었는지 확인하십시오.
11. 임팩터가 브레그마 중앙에 올 때까지 임팩터를 정렬합니다(그림 1K 참조).
12. 입체 리더의 디지털 입체 x 및 y 좌표를 0으로 재설정합니다(터치 스크린 컨트롤에서)
13. 프로브를 브레그마에서 대상 좌표(내측 = 0.0mm, 전방-후방 = -1.6mm)로 이동하여 충격 위치 위에 프로브를 정렬합니다.
14. 접촉 센서를 동물의 귀에 클립합니다.
    1. 표면에 처음 닿을 때까지 확장된 프로브로 프로브 팁을 천천히 내립니다. 신호음이 울리면 멈춥니다.
    2. 입체 리더의 디지털 입체 z 좌표를 0으로 재설정합니다.
15. 팁이 두개골과 같은 높이인지 주의 깊게 검사합니다(내측 및 전방-후방 평면).
    참고: 프로브 팁의 위치를 지정하는 것은 두개골 골절과 귀 손상을 방지하기 위한 이 과정에서 가장 중요한 단계입니다.
16. 컨트롤 박스의 토글 스위치를 Retract 위치에 놓아 임팩터를 후퇴시킵니다. 팁은 물러나고 충격이 가해질 때까지 동물의 머리에 더 이상 닿지 않습니다.
17. 등쪽-복부 깊이를 -1.2mm로 조정하여 충격 깊이를 설정합니다.
    참고: 충격의 깊이는 부상의 심각성에 영향을 미칩니다. 깊이는 원하는 부상 심각도에 따라 마우스의 연령, 체중 및 변형률에 따라 역가되어야 합니다. 일관된 부상 심각도를 유지하기 위해 시간이 지남에 따라 깊이를 조정/재역가해야 할 수 있습니다. 중증도는 신경병리학적으로 평가할 수 있습니다: 미세아교세포 및 성상세포(Immunohistochemistry (IHC)) 및 행동적으로: 요골 팔 물 미로 및 능동적 회피 테스트.
18. 마우스의 호흡을 주의 깊게 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 가스 수준을 조정합니다.
    참고: 종종, 이소플루란 가스의 비율은 충격이 가해지기 10-20초 전에 낮추거나 차단해야 합니다. 호흡이 약간 가속되는지 자세히 관찰하십시오. 충돌 시 호흡이 너무 느리면 동물은 무호흡으로 인한 충격 후 첫 60초 이내에 죽을 수 있습니다. 이는 충격이 가해지기 몇 초 전에 마취 깊이를 조정하여 예방할 수 있습니다.
19. 오른쪽 토글 스위치를 impact로 눌러 충격을 유도합니다. 프로브 팁은 표시된 속도로 내려간 다음 설정된 체류 시간 동안 내려간 상태를 유지하고 후퇴합니다.
    참고: 샴 마우스는 CHI 마우스와 동일한 취급을 받지만 충격은 전달되지 않습니다.
20. CHI 임팩트가 전달된 직후 타이머를 시작하여 올바른 시간(측면 위치에서 엎드린 자세로 돌아가는 시간)을 기록하거나 가짜 마우스의 입체 프레임에서 마우스를 제거할 때 타이머를 시작합니다. 평균 우측 반사 시간은 5-15분입니다.
    참고: 우측 반사 시간은 마우스 변형과 연령에 따라 다를 수 있습니다.
21. 마우스에서 눈에 보이는 두개골 골절, 출혈 및 무호흡증이 있는지 평가합니다. 함몰된 두개골 골절 또는 눈에 띄는 출혈이 있는 쥐는 연구에서 제외합니다.
    참고: 두개골 골절에는 등급이 매겨진 수준이 있습니다. 뼈가 눈에 띄게 뇌 조직을 누르는 감압된 두개골 골절이 있는 동물은 안락사됩니다(먼저 CO₂, 2차 방법으로 참수를 사용합니다). 임팩터 팁이 올바르게 설정되면 이러한 유형의 두개골 골절은 극히 드뭅니다. 두개골 골절이 발생하면 더 흔한 증상은 두개골에 작은 핏방울이 떨어지고 두개골이 약간 촉각적으로 거칠어지는 것이며, 종종 코뼈의 뒤쪽 끝을 연결하는 봉합선을 따라 두개골이 거칠어지는 것입니다. 이 마우스는 기록에서 두개골 골절 가능성이 있는 것으로 기록되어 있지만 일반적으로 연구에서 제외되지는 않습니다.
22. 입체 안경테에서 동물을 제거합니다.
23. 피부를 함께 스테이플링하여 두피를 닫습니다.
    참고: 흡수성 또는 비흡수성 봉합사는 스테이플의 대안으로 두피를 봉합하는 데 사용할 수 있습니다.
24. 멸균된 솜 팁 어플리케이터로 삼중 항생제 연고를 닫힌 절개 부위에 바릅니다.
25. 복구를 위해 마우스를 깨끗한 보관 케이지에 다시 넣으십시오. 회수 케이지의 절반은 가열 패드(낮은 설정)에 있어 깨어 있을 때 열에서 멀어지고 의식이 없는 동안 동물의 온도를 유지할 수 있습니다(그림 그림 1L 참조).
    참고: 마우스는 복구 케이지에서 옆으로 눕혀져 있습니다. 질식을 방지하기 위해 동물을 침구가 없는 회복 케이지에 넣거나 케이지 안에 침구가 있는 경우 티슈 위에 놓습니다.
26. 확장/축소 토글 스위치를 중앙/끄기 위치로 되돌립니다.
    참고: 스위치가 확장 또는 수축 위치에 남아 있으면 전류가 계속 작동하여 피스톤이 팽창합니다. 그러면 임팩터는 피스톤이 식을 때까지 작동하지 않습니다.
27. 홀더에서 임팩터를 제거하고 얼음 팩 위에 부드럽게 올려 놓습니다.
    참고: 임팩터를 얼음 팩에 보관하면 임팩터의 잠재적인 팽창을 줄이는 데 도움이 됩니다.
28. 바로잡기 반사가 일어날 때까지 동물을 모니터링하고 바로잡기까지의 시간을 문서화합니다(그림 1M 참조).
    참고: 오른쪽 반사는 마우스가 엎드린 위치로 돌아가는 순간으로 정의됩니다. 케이지는 방해받지 않고 그대로 두어야 합니다. 쥐는 케이지를 만지거나 움직이거나 약간의 소음에 노출되면 바로갈 수 있습니다.
29. 쥐가 깨어 있고 깨어 있을 때 집 우리로 되돌려 놓습니다. 일반적으로 부상 후 1시간 이내에 동물은 완전히 의식을 갖고 걸을 수 있습니다. 또한 케이지 바닥에 촉촉한 음식을 넣으십시오.

결과

그림 1: 1단계: 수술 부위 설정. (A) CHI 수술을 수행하는 데 필요한 수술 부위 및 도구(임팩터용 얼음찜질, 임팩터가 장착된 입위 프레임, 임팩터 컨트롤 박스 및 수술 도구)의 예가 표시됩니다. (B) 5mm 강철 프로브 팁, 바이트 바 및 머리 지지 장치의 클로즈업 보기는 정중선 충격에 필요한 위치를 보여줍니다. (C) 머리 지지 장치는 파라필름으로 튜브에 부착된 1mL 라텍스 피펫 전구로 만들어집니다. 10mL 주사기에는 전구를 팽창시키기 위해 물을 채우고, 제자리에 놓이면 전구를 팽창시킨 상태로 유지하기 위해 마개가 있습니다. (D

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm 자동 클립 리무버	Braintree scientific	ACS- RMV	수술
9mm 자동 클립, 1,000개 클립 케이스	Braintree scientific	ACS- CS	수술(스테이플)
Aperio ImageScope 소프트웨어	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Cotton tip applicator	VWR	89031-270	Surgery
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Surgery
이어바	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for Small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21	머리 지지 장치
Gemini Avoidance System	San Diego Instruments	NA	Active avoidance
Heating Pad	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
유도실	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	수술 준비
이소플루란, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	수술
마우스 가스 마취 헤드 holder	Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Neuroscience Tools	n/a	Surgery: Lecia에 의해 임팩트 one
NexGen Mouse 500으로 공식적으로 배포됨	Allentown	n/a	수술 후, 케이지
파라필름	Bemis	PM992	머리 지원 장치
땅콩 - 전문 이발<	8655-200	Surgery prep
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) 사용 가능한 요오드, 실험실용	Ricca	3955-16	Surgery
Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Surgery
토끼 anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
토끼 안티 IBA1	Wako	019-19741	IHC
8-arm 방사형 암 워터 메이	MazeEngineers	n/a	RAWM
Scale	OHAUS CS 시리즈	BAL-101	수술 준비
메스 핸들 #7 솔리드 6.25"	Roboz	RS-9847	Surgery
멸균 알코올 준비 패드(이소프로필 알코올 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750	수술 준비
SumnoSuite 저유량 마취 시스템<	SS-01	Surgery
10 mL syringe Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Head support apparatus
timerrs	Fisher Scientific	6KED8	수술
국소 마취 크림	L.M.X 4	ndc 0496-0882-15	Surgery prep
Triple antibiotic ointment	Major	ndc 0904-0734-31	Post-surgery
tubing	MasterFlex	96410-16	머리 지지 장치
Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Surgery prep

보유td 스타일='너비:149pt;'>Whal즈td 스타일='너비:149pt;'>켄트 Scientific