Calcium Dynamics and Membrane Potential Changes in a Mouse Arteriolar Endothelium(쥐 세동맥 내피의 칼슘 역학 및 막 전위 변화 분석)

초록

출처: Hakim, M. A. et al., Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 쥐의 뇌에서 분리된 세동맥 내피관의 기능 분석을 보여줍니다. 이 연구는 기준선에서 그리고 약리학적 자극에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 수준과 막 전위를 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리에 의해 검토되고 승인되었습니다. 검토 위원회.

1. 재료 및 장비

참고: 참조하십시오. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>재료 표. 또한 필요에 따라 각 공급업체와 관련된 매뉴얼 및 웹 사이트도 참조할 수 있습니다.

1. flow chamber
   1. 유리 커버슬립이 있는 초융합 챔버를 양극 산화 처리된 알루미늄으로 구성된 플랫폼에 고정합니다. 챔버가 있는 플랫폼을 알루미늄 현미경 스테이지에 고정합니다.
   2. 알루미늄 현미경 스테이지의 플랫폼 양쪽 끝에 피닝 피펫을 잡고 있는 micromanipulator를 설정합니다.
      참고: 필요한 경우, 플로우 챔버 장치와 함께 이동 가능한 스테이지 장치를 사용하여 실험을 위해 안전하고 격리된 내피 튜브를 한 현미경 장치에서 다른 현미경 장치로 이동합니다.
2. microscopes
   1. 진동 차단 테이블 위에 도립 현미경(대물렌즈: 4x, 10x, 20x, 40x, 60x)과 수동 알루미늄 스테이지를 배치하여 실험 장치를 설정합니다.
3. Intracellular V_m 녹음 장비
   1. 전위계를 호환 가능한 헤드스테이지에 연결합니다. 전류 주입이 필요한 프로토콜에 대해 함수 발생기 및 자극기와 같은 액세서리를 사용하십시오.
   2. 앰프 출력을 데이터 디지타이저 시스템, 오실로스코프 및 가청 베이스라인 모니터에 연결합니다. 유동 챔버 출구 근처에 기준 수조 전극(Ag/AgCl 펠릿)을 고정합니다.
   3. 형광 시스템 인터페이스, 고강도 아크 램프 및 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치, 광전자 증배관(또는 PMT) 및 카메라의 통합 구성 요소가 포함된 광도 측정 시스템을 조립하여 [Ca²⁺]_i 내피 세포에서.
   4. 인라인 히터가 장착된 온도 조절기를 조립하여 실험 내내 생리적 온도(37°C)를 높이고 유지합니다.
   5. 인라인 유량 제어 밸브가 있는 밸브 컨트롤러에 연결된 다중 채널 플랫폼을 조립하여 챔버에 고정된 내피 튜브로의 솔루션 전달을 제어합니다.
4. 마이크로피펫 및 날카로운 전극
   참고: 실험자는 피닝을 준비하기 위해 전자 유리 풀러와 마이크로포지가 필요합니다. 피 펫.
   1. superfusion chamber에 내피관을 고정하려면 얇은 벽의 붕규산 유리 모세관으로 준비된 뭉툭한 구형 끝(외경: 50-70μm)이 있는 열 연마 피펫을 준비합니다.
   2. V_m 유리 풀러만 사용하여 유리 모세관에서 ~150 ± 30MΩ의 팁 저항을 가진 날카로운 전극을 준비합니다.

2. 솔루션과 약물

1. 생리적 염 용액 (PSS)
   1. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl을 사용하여 최소 1L의 PSS를 준비<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2- 에탄 술폰산 (HEPES) 및 10mM 포도당.
   2. CaCl₂ (0 Ca²⁺ PSS) 대뇌 세동맥 해부 및 내피 격리 튜브.
      참고: 모두 준비 초순수 탈 이온화 된 솔루션 H₂O, 여과 (0.22 μm)가 뒤따릅니다. 최종 제품에 삼투압이 290에서 300mOsm 사이인 pH 7.4가 포함되어 있는지 확인합니다.
2. Fura-2 및 약리제
   1. dimethyl sulfoxide(DMSO, 1 mM)로 Fura-2 AM 스톡을 준비합니다. 로딩을 위해 495μL의 PSS에 5μL의 스톡을 추가하여 500μL의 작업 농도(10μM)를 준비합니다.
   2. 적절하게 PSS 또는 DMSO에서 최소 50mL의 약리학적 제제의 작업 농도를 준비합니다.
3. 전도 솔루션
   1. KCl을 deionized H₂O (50mL의 H₂O).날카로운 전극을 다시 채우기 전에 0.22μm 필터가 있는 주사기를 통해 용액을 통과시킵니다.

3. 세포 생리학 검사를 위한 세동맥 내피관의 활용

참고: 격리되고 안전한 세동맥 내피관은 [Ca²⁺의 세포 내 녹음에 사용할 수 있습니다.]_i dynamics and V_m 앞에서 설명한 것처럼 각각 측광 및 날카로운 전극 전기 생리학을 사용합니다(그림 1). [캘리포니아²⁺]_i 및 V_m는 별도의 또는 결합된 실험 변수로 측정할 수 있습니다(그림 1). 그러나 세동맥 내피관은 동맥 내피보다 섬세하므로 실험 시간은 1시간을 초과해서는 안 됩니다.

1. [ca²⁺]_i
   1. [Ca²⁺]_i 기록 분.
   2. Ca²⁺ 실온에서 Fura-2 AM을 30분 동안 염색합니다. 수조 온도를 점차적으로 37°C로 높이면서 20-30분 동안 과융합 용액으로 세포를 세척합니다. 실험 내내 온도를 37°C로 유지합니다.
   3. ~20개의 내피 세포에 초점을 맞추기 위해 측광 소프트웨어를 사용하여 이미징 창을 수동으로 조정합니다(그림 1A). 빛이 없을 때 PMT를 형광 인터페이스로 켜고 [Ca²⁺ 획득을 시작합니다.]_i 510nm에서 형광 방출을 수집하면서 340nm와 380nm에서 교대로(≥10Hz) Fura-2를 자극합니다. 일단 [Ca²⁺]_i 확립되면 약리제(예: 퓨린성 수용체)를 적용하십시오. agonists) 실험 목표에 따라 (그림 1B).
2. V_m
   1. V_m 기록을 수행하고 데이터 수집 속도(≥10Hz)를 설정하면서 5-7mL/분의 유속으로 연속 과융합을 유지합니다. 점차적으로 수조 온도를 37°C로 올리고 실험이 끝날 때까지 유지합니다.
   2. 붕규산 유리 모세관을 사용하여 날카로운 전극을 당기고 2M KCl로 되메우고 마이크로 매니퓰레이터에 의해 유지되는 전위계에 부착된 피펫 홀더에 염화물로 코팅된 은색 와이어로 고정합니다.
   3. 4x 대물렌즈를 통해 보는 동안 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 날카로운 전극 끝을 세동맥 내피관의 세포 바로 위에 챔버의 흐르는 PSS에 조심스럽게 배치합니다.
   4. 점차적으로 배율을 400배로 늘리고 필요에 따라 전극 팁의 위치를 조정합니다.
   5. 미세 조작기를 사용하여 날카로운 전극의 끝을 내피 튜브의 세포 중 하나에 부드럽게 삽입하고 V_m 전위계를 사용합니다(그림 1A).

일단 내피 휴식 V_m 안정적 (-30--40 mV), 원하는 약리학을 적용하십시오. 실험적 목표당 에이전트(그림 1C).

결과

그림 1: 혈류 조절과 관련된 경로의 생리학적 검사를 위한 내피관의 적용.(A) 날카로운 전극(보라색 화살표)이 측광을 위해 데이터 수집 창에 초점을 맞춘 내피관의 셀에 배치됩니다. (B) MTA(1μM)에 대한 반응으로 Fura-2 측광법을 사용한 세포 내 Ca²⁺의 대표적인 기록. (C) 패널 B에서 세포 내 Ca²⁺ 트레이스_{와 동시에 Vm}의 대표 기록. (D) 형광 염료로 염색된 살아있는 내피 세포의 원형질막(녹색)과 핵(빨간색)의 대표 이미지. (E) 형광 염료로 염색된 살...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
배스 냉각기(Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647 <
Warner Instruments	G150T-6
붕규산 유리 모세관(날카로운 전극)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA : 소 혈청 알부민	시그마	A7906
CaCl2 : 염화칼슘	시그마	223506
DMSO : 디메틸 설폭 사이드	시그마	D8418
유량 제어 밸브	워너 인스트루먼트 FR-50
형광 시스템 인터페이스, ARC 램프 및 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치 및 PMT	분자 장치, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix 시스템
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
인라인 솔루션 히터	Warner Instruments	SH-27B
KCl: 염화칼		Sigma P9541
MgCl2: 염화마그네슘	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
현미경 ( 니콘 인	스트루먼트 Inc	Eclipse TS100
현미경 objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, 그랜트 패스, 오레곤, 미국	8090P
MTA : 2- 메틸 티오 아데노신 디 포스페이트 트리 소듐 염	Tocris	1624
NaCl : 염화나트륨	시그마	S7653
NaOH : 수산화 나트륨	시그마	S8045
오실로스코프	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
위상차 objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
주사기 필터 (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
온도 컨트롤러 (듀얼 채널)	Warner Instruments	TC-344B 또는 C
밸브 제어 시스템	Warner Instruments	VC-6
방진 테이블	기술 제조, 미국 매사추세츠주 피바디	Micro-g

td 스타일='높이:14.5pt;'>붕규산 유리 모세관(고정)륨