Assessment of Excitatory Neurotransmitter Levels in Chronic Epilepsy-Induced Rats

초록

출처: Soukupová, M., et al. 자유롭게 움직이는 쥐에서 EEG 기록 중 흥분성 아미노산의 미세 투석. J. Vis. Exp. (2018)

이 비디오는 만성 간질 유도가 있는 쥐의 세포외 흥분성 신경전달물질 수치 평가를 보여줍니다. 미세 투석 프로브를 뇌에 이식하고 뇌파검사(EEG)를 사용하여 발작이 없음을 확인한 후, 간질성 쥐의 상승된 신경전달물질 수치를 평가하기 위해 세포외액을 수집합니다. 그런 다음 고칼륨 용액을 주입하여 신경 흥분성을 유지하고 신경 전달 물질의 방출을 증가시키고, 흥분성 신경 전달 물질에서 칼륨 유도 피크를 평가하기 위해 샘플을 수집합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

이 프로토콜은 간질성 및 비간질성 쥐의 미세 투석 세션의 EEG 제어 하에 얻은 쥐 뇌 투석액에서 글루타메이트 및 아스파르테이트 측정을 위해 특별히 조정되었습니다. 여기에 기술된 많은 물질은 EEG 기록이나 미세 투석을 위해 실험실에서 사용하는 물질로 쉽게 대체될 수 있습니다.

1. 미세투석 프로브 전극 장치의 조립

1. 3채널 2연전극(등록 전극의 절단 길이 20mm 이상, 접지 전극 길이 10cm 이상)을 사용하고 가이드 캐뉼라에 연결하여 장치를 준비합니다. 투석을 위한 3채널 전극 및 가이드 캐뉼라의 예는 그림 1A-1B에서 확인할 수 있습니다.
2. 제거(그림 1C)와 사용 전에 더미 플라스틱 캐뉼라에 금속 가이드 캐뉼라를 몇 번 삽입(그림 1D)하여 동물의 미세 투석 프로브로 전환하는 순간에 제거를 용이하게 합니다.
3. 등록 전극의 꼬인 와이어를 두 번(그림 1E-1F) 구부려 와이어를 가이드의 더미 캐뉼러와 정렬하고 디지털 캘리퍼를 사용하여 전극 팁(그림 1G)을 가이드 캐뉼라(H)의 끝보다 0.5mm 길게 자릅니다.
4. 1mm 길이의 실리콘 서클릿(O.D. 2mm, 두께 0.3mm; 그림 1I)을 준비하고 핀셋을 사용하여 가이드 캐뉼라의 끝과 꼬인 전극의 끝을 실리콘 서클릿에 삽입합니다(그림 1J). 빠른 작용의 폴리머 접착제 또는 수지로 가이드 캐뉼라 받침대의 발에 고정하십시오 (그림 1K). 그림 1L 및 그림 2A에서 완성된 장치의 예를 참조하십시오.
5. 살균 자외선 아래에서 장치를 4시간 동안 살균하십시오. 각 면이 1시간 동안 빛에 노출되도록 장치를 네 번 뒤집습니다.
   참고: 많은 집에서 만든 전극과 미세 투석 프로브는 유사한 방식으로 조립될 수 있습니다. 상술한 쥐용 임플란트의 머리는 다음과 같은 치수를 갖는다: 7 mm 너비 x 5 mm 깊이 x 10 mm 길이, 상단에서 받침대 발가락까지; 임플란트 팁은 길이 약 11mm, 직경 600μm이며 모든 장치 무게는 약 330-360mg입니다. (i) 다음 사용을 위해 수술하는 동안 두개골에 충분한 길이의 접지 전극이 남아 있고 (ii) 동물이 죽었을 때 장치를 치과 시멘트와 함께 회수하여 시멘트가 기계적으로 분해될 수 있도록 하룻밤 동안 아세톤에 남겨두었을 때, 장치를 2회 또는 3회 재사용할 수 있습니다. 그리고 장치를 세척하고 다시 살균했습니다.

2. 정위 수술

1. 무균 및 무통 수술에 대한 현대 표준에 따라 장치 이식을 위해 정위 보조 장치와 프로브 클립 홀더(그림 2B)를 사용하십시오.
   1. 성체 Sprague-Dawley 쥐를 케타민/자일라진 혼합물(43mg/kg 및 7mg/kg, ip)로 마취하고 입체 프레임에 고정합니다. 초기 케타민/자일라진 주사에 이소플루란 마취제(공기 중 1.4%, 1.2mL/분)를 추가하면 마취 깊이를 적시에 제어할 수 있습니다. 동물의 머리에 있는 털을 면도합니다.
2. 요오드 기반 용액으로 머리 피부 표면을 면봉으로 닦은 다음 70% 에탄올을 주입하여 무균 수술을 준비합니다.
   1. 다음 좌표를 사용하여 우선 (1.1 – 1.5)으로 준비된 가이드 캐뉼러 전극 장치를 오른쪽 복부 해마에 이식합니다 : 코 막대 + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm 브레그마. 정위 수술을 위한 표준 기술을 따르십시오.
   2. 고정 나사를 덮지 않는지 확인하십시오. 입체택시 장치에 장착할 때 프로브 홀더에 쉽게 정렬될 수 있으므로 가이드 캐뉼러 헤드용 장치를 잡으십시오.
3. 두개골 뼈에 나사로 고정하는 최소 4개의 스테인리스 나사(왼쪽 뼈에 나사 1개, 오른쪽 정면 뼈판에 나사 1개, 왼쪽 두정골에 나사 1개, 두정골 플레이트에 나사 1개). 조직 접착제 한 방울을 추가하여 각 나사를 두개골 뼈에 추가로 고정합니다.
   위치
   1. 나사산의 절반을 메타크릴 시멘트로 덮습니다. 접착력을 높이기 위해 뼈에 얕은 홈을 만들어 시멘트의 결합을 촉진합니다.
4. 장치의 끝이 뇌 조직에 배치되면 접지 전극의 와이어를 3개의 고정 나사로 꼬아줍니다. 장착된 모든 나사와 장치를 치과용 시멘트로 덮습니다.
5. 수술 중과 그 후 똑바로 서서 케이지 주위를 이동할 때까지 약 1시간 동안 동물을 모니터링합니다. 저체온증을 피하기 위해 보온 패드에 보관하십시오. 장치 이식 후 최소 7일 동안 쥐가 회복할 수 있도록 합니다.
6. 수술 후 3일 동안 적어도 하루에 한 번 동물에게 통증이나 고통의 징후가 있는지 모니터링하십시오. 감염 예방을 위해 절개 부위에 항생제 크림(겐타마이신 0.1%)을 바르고 진통제(트라마돌 5mg/kg, 복강내[i.p.])를 3일간 투여하여 수술 후 통증을 예방합니다.

3. 필로카르핀에 의한 측두엽 간질 유도 및 실험 그룹에 동물 할당

1. 수술 후 일주일 후, 동물을 (i) 차량을 받는 대조군 동물과 (ii) 필로카르핀을 투여할 간질 동물에 무작위로 할당합니다. 간질 그룹에 대해 비례적으로 더 많은 수의 동물을 사용하는데, 이는 필로카르핀을 투여한 모든 쥐가 질병에 걸리는 것은 아니기 때문입니다.
2. 메틸스코폴라민(1mg/kg, 피하[s.c.])을 투여하고 30분 후 필로카르핀(350mg/kg, i.p.)을 1회 주사하여 간질(SE) 상태를 유도합니다. 메틸스코폴라민과 비히클(식염수)을 대조군 쥐에 주입합니다. 모든 I.P. 투여에 25G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하십시오.
   1. 동물이 행동 발작(5분 이내에 비브리사 이동, 고개 끄덕임, 팔다리 복제)을 시작하고 25분 이내에 몸 전체(SE)를 지속적으로 복제하기 시작하는지 육안으로 확인하십시오.
3. 발병 후 2시간 후에 SE를 정지시켜 약 25%의 사망률과 약 10일의 평균 잠복기를 갖도록 한다(20 mg/kg, i.p.). 필로카르핀 주사 직후 시작되는 모든 발작 행동을 관찰하고 기록하고 그 후 최소 6시간 동안 계속합니다.
4. 체중 감량의 회복을 촉진하기 위해 체중 감량의 회복을 촉진하기 위해 25G 바늘과 자당 용액(1mL, per os [p.o.])을 사용하여 1mL 주사기와 17G 바늘을 사용하여 동물에게 식염수(1mL, i.p.)를 투여합니다.
   1. 필로카핀 SE 후 첫 주 이내에 초기 체중에 도달하지 못한 동물은 연구에서 제외합니다(체중 추적이 불가능한 SE 후 24시간 후에 사망한 급성 그룹 제외).
5. SE 후 동물을 다른 실험 그룹에 무작위로 할당합니다(그림 3): 급성기(SE 후 24시간 후에 미세 투석이 이루어짐), 잠복기(SE 후 7-9일), 첫 번째 자연 발작(SE 후 약 11일) 및 만성 기간(SE 후 약 22-24일 후, 즉 첫 발작 후 약 10일 후). 동물이 자연 발작이 발생하는지 모니터링합니다.
   참고: 간질성 쥐에 대한 추가 실험을 위해 다음 포함/제외 기준을 사용하십시오: 필로카르핀 투여 후 1시간 이내에 경련성 SE의 발달; SE 후 첫 주에 체중 증가와 미세 투석 프로브와 전극의 올바른 위치.

4. 간질 행동 모니터링 및 분석

1. 간질 행동에 대한 장기 모니터링
   1. 필로카르핀 투여 후 약 6시간(, 즉 , 연구자의 직접 관찰 끝) 동물을 깨끗한 가정용 케이지에 넣고 24시간 비디오 모니터링을 시작합니다.
   2. 디지털 비디오 감시 시스템을 사용하여 5일차까지 24시간 비디오 모니터링을 계속합니다.
   3. 5일차부터 집 직사각형 케이지에 있는 쥐를 테더링된 EEG 기록 시스템에 연결하고 24시간 비디오 모니터링을 계속합니다.
   4. 패러데이 케이지 외부에 위치한 증폭기의 매개변수를 설정하고(각 단일 동물의 EEG 신호의 특이성에 따라 각 채널의 증폭 계수 설정) 연결되지 않은 케이블에서 생성되는 EEG 신호를 관찰하면서 EEG 수집을 시작합니다. 샘플링 속도 200Hz와 0.5Hz로 설정된 저역 통과 필터를 사용합니다.
   5. 동물을 케이블에 연결하여 한 손의 뻗은 두 손가락 사이에 동물의 머리를 잡고 다른 다른 손으로 커넥터를 전극 받침대에 나사로 고정합니다. 인수를 시작합니다.
      주의: 신호에 아티팩트가 없는지 확인합니다. 일반적인 아티팩트는 스케일을 크게 초과하는 스파이크입니다.
   6. 미세투석 실험 하루 전, 미세투석을 위해 플렉시글라스 실린더가 장착된 테더형 EEG 시스템으로 동물을 옮깁니다. 가정용 케이지의 EEG 테더링 시스템에서 동물을 분리하고 동물을 구속하지 않고 전극에서 커넥터를 조입니다. 동물을 높은 플렉시 글라스 실린더에 넣습니다.
2. 미세투석 세션 하루 전과 도중 간질 행동 모니터링
   1. 패러데이 케이지 외부에 위치한 증폭기를 켭니다. EEG 소프트웨어를 엽니다. 연결되지 않은 케이블에서 생성되는 EEG 신호를 관찰하여 EEG 획득을 시작합니다.
   2. 동물을 밧줄로 묶인 EEG 기록 시스템에 연결하고 한 손의 뻗은 두 손가락 사이에 동물의 머리를 잡고 다른 다른 손을 사용하여 전극 받침대에 커넥터를 나사로 고정합니다. EEG 신호가 스케일이 되도록 단일 동물의 전극 신호에 따라 증폭기의 각 채널에 증폭 계수(게인)를 설정합니다. 동물이 연구원의 직접 관찰하에 최소 1시간 동안 새 케이지(실린더)를 탐색하도록 합니다.
   3. 참고: 미세투석 실험 24시간 전, 쥐는 가이드 캐뉼라를 미세투석 프로브로 전환하기 위해 이소플루란으로 잠시 마취됩니다. 마취되는 순간을 활용하여 EEG 기록 시스템에 연결하십시오.
   4. 동물의 상품에 따라 늘어진 케이블을 줄이거나 연장하십시오. 케이블이 동물의 움직임과 누워있는 자세를 방해하지 않는지 확인하십시오.
   5. 비디오 카메라의 이미지 프레임이 올바른지 확인하십시오. 비디오 EEG 녹화를 시작합니다.
3. 발작 및 EEG 활동 식별
   1. 소프트웨어 플레이어를 사용하여 비디오를 시청하십시오. 실시간 재생보다 8배 빠르게 영화를 스크롤하고 전신 발작을 개별화합니다(앞다리 간대증으로 동물을 기르고 넘어지는 동물 또는 앞다리 간대증으로 동물을 기르고 넘어지는 것을 참조하십시오). 비디오의 속도를 늦추고 행동 발작이 시작되고 끝나는 정확한 시간을 기록하십시오.
   2. 24시간의 비디오 기록에서 관찰된 전신 발작 횟수를 세어 데이터를 처리하고 24시간 동안 관찰된 모든 발작의 평균값으로 발작 빈도 및 지속 시간으로 표현합니다.
   3. EEG 발작을 지속되는 스파이크 빈도의 진행에 따라 기준선에서 >3배 진폭 증가를 특징으로 하는 고주파(>5Hz)의 발작성 활동 기간으로 정의합니다. 최소 3초 또는 이와 유사합니다. EEG 소프트웨어를 사용하여 원시 EEG 기록을 처리합니다. EEG 트레이스를 1시간 분수로 나눕니다. 소프트웨어 자동 스파이크 분석을 위해 EEG 추적 분획을 파일에 복사합니다.
   4. EEG 소프트웨어와 사전 정의된 매개변수(4.3.3.)를 사용하여 EEG 활동 데이터를 분석합니다. 분석된 동물 그룹에 대해 시각 장애가 있는 두 명의 독립적인 조사관을 통해 모든 비디오 분석을 수행합니다. 의견 차이가 있는 경우 합의에 도달하기 위해 함께 데이터를 재검토하도록 합니다.

5. 미세투석

1. 시험관에서 프로브 회복
   1. 제조업체의 지침에 따라 프로브를 처음 사용할 수 있도록 준비하고 보호 슬리브에 넣어 취급합니다.
   2. 실험을 3단계로 실행합니다: 표준물질(2.5μM의 글루타메이트 2.5μM 및 아스파르테이트 2.5μM)의 혼합물을 포함하는 1mL의 Ringer's solution을 주입하는 3개의 1.5mL 테스트 튜브를 준비합니다. 3개의 장전된 1.5mL 시험관을 37°C로 설정된 블록 히터에 넣고 교반기에 놓습니다.
      참고: 크로마토그래피 보정에 동일한 표준 용액을 사용하십시오.
   3. 1.5mL 시험관을 파라핀 필름으로 밀봉하고 날카로운 핀셋으로 구멍을 뚫어 직경 약 1mm의 구멍을 만듭니다.
   4. 프로브를 가져 와서 파라핀 필름으로 만든 구멍에 삽입하십시오. 멤브레인을 용액 수준 아래 최소 2mm 깊이에 담그십시오. 파라핀 필름으로 프로브를 1.5mL 시험관에 추가로 고정합니다.
      주의: 팁이 1.5mL 시험관의 벽에 닿지 않도록 하십시오.
   5. 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP)--튜빙 및 튜빙 어댑터를 사용하여 프로브 주입구를 주입 펌프에 장착된 주사기에 연결합니다. 선택적으로 0.28mm 내경(ID) 및 0.61mm 외경(OD)의 미세 보어 폴리에틸렌 튜빙과 유색 튜빙 어댑터(빨간색 및 파란색 튜빙 어댑터)를 연결하여 사용할 수 있습니다.
   6. 2 μL/min에서 펌프를 시작하고 유체가 배출구 팁에 나타나도록 합니다. FEP 튜빙 및 튜빙 어댑터를 사용하여 프로브 배출구를 0.2mL 수집 테스트 튜브에 연결합니다.
      참고: 모든 연결에 FEP 튜빙을 사용합니다. 면도날을 사용하여 원하는 길이의 튜브를 자릅니다. 프로브의 입구와 출구에 다른 색상의 튜브 어댑터를 사용하십시오. 펌프를 60분 동안 작동시킵니다. 누출 및 기포를 확인하십시오. 이러한 항목이 있으면 안 됩니다.
   7. 펌프를 2μL/분의 유속으로 설정하고 튜브의 출구 쪽에서 시료 수집을 시작합니다.
   8. 1.5mL 시험관에 30분 분량의 관류액 시료 3개와 동일한 부피의 용액 시료 3개를 수집합니다. 1.5mL 시험관의 표준 용액에 담근 마이크로 주사기를 사용하여 30분마다 1.5mL 시험관에서 동일한 부피의 샘플을 채취합니다.
   9. 실험(5.1.1-5.1.8)을 반복하여 펌프를 3μL/min(5.1.7)의 유량으로 설정하여 두 가지 다른 관류 유량을 사용할 때 프로브 회수율을 비교합니다.
   10. 완료되면 펌프를 멈추고 증류수, 70% 에탄올로 튜브를 헹구고 공기를 밀어 넣습니다. 깨끗한 증류수를 채운 바이알에 프로브를 보관하십시오. 보관 전에 증류수로 프로브를 2μL/분으로 관류하여 프로브를 철저히 헹굽니다.
   11. 크로마토그래피로 샘플의 글루타메이트 및 아스파르테이트 농도를 분석합니다.
   12. 다음 방정식을 사용하여 회수량을 계산합니다.
       회수(%) = (C_관류액 /C_투석액) x 100.
2. 자유롭게 움직이는 쥐의 미세투석 세션
   1. 준비 절차: 프로브 삽입 및 테스트, 주입 펌프 설정 및 시작
      1. 제조업체 사용자 가이드에 따라 최초 사용을 위한 미세투석 프로브를 준비하고 Ringer의 솔루션으로 채웁니다. 약 10cm 길이의 FEP 튜빙 조각을 자르고 다양한 색상의 튜빙 어댑터를 사용하여 프로브의 입구 및 출구 캐뉼러에 연결합니다.
      2. 튜브가 모든 연결부에 데드 스페이스가 없는 어댑터에 닿는지 확인하십시오.
      3. 미세투석 실험 24시간 전, 유도실에서 이소플루란(공기 중 5%)으로 동물을 누울 때까지 잠시 마취합니다. 핀셋을 사용하여 가이드에서 더미 캐뉼러를 제거하고 동물의 머리를 단단히 잡습니다. 투석막이 부여된 미세투석 프로브를 가이드 캐뉼라에 삽입하고 점토를 모델링하여 가이드에 삽입된 미세투석 캐뉼라를 더 단단히 고정합니다.
         주의: 추출할 때 프로브가 보호 프로브 슬리브의 벽에 닿지 않도록 하십시오.
      4. 동물을 플렉시글라스 실린더에 넣고 새로운 환경을 탐험하게 합니다. 위에서 설명한 대로 동물을 테더링된 EEG 기록 시스템에 연결합니다(4.2.2 및 4.2.3 항목 참조).
      5. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐의 움직임을 따르고 튜브 어댑터를 사용하여 Ringer's solution이 들어 있는 무딘 22G 바늘이 있는 2.5mL 주사기에 프로브의 입구를 연결합니다. Ringer's solution을 프로브 내부로 밀어 10초 후에 Ringer's solution 10을 배출하고 2.5mL 주사기의 피스톤을 계속 밀어 넣습니다. 콘센트에 액체가 떨어지지 않는지 확인하십시오. 이제 프로브를 사용할 준비가 되었습니다.
      6. 튜브 어댑터로 FEP-튜브에 연결된 2.5mL 주사기에 Ringer의 용액을 채우고 주입 펌프에 장착합니다. 2μL/분에서 펌프를 시작합니다. 하룻밤 동안 실행하게하십시오.
         참고: 모든 FEP-튜빙의 원하는 길이를 사용하되 튜빙 데드 볼륨을 계산하여 높은 K⁺ 자극이 시작되어야 하는 시점을 파악하고 정량화 데이터를 동물 뇌의 신경화학적 변화와 연관시킵니다. 작업 흐름 아래의 튜브에 생성된 기포를 사용하여 이 시간을 계산합니다.
   2. EEG 기록 및 칼륨 자극 중 샘플 채취
      1. 샘플 채취가 시작되기 전 3시간 동안 발작이 없었는지 확인하고(비디오-EEG 기록) 미세 투석 중 발작 활동을 계속 모니터링합니다.
      2. Ringer의 용액으로 채워진 FEP 튜빙 캐뉼러 주사기를 운반하는 펌프를 중지합니다. 100mM K{{⁺ 용액을 포함하는 수정된 Ringer 용액으로 채워진 튜브 어댑터가 있는 FEP 튜빙에 연결된 또 다른 2.5mL 주사기 세트를 펌프에 장착합니다.
      3. 펌프를 2μL/min으로 시동하고 작동시킵니다. 튜빙을 보다 빠르게 주입하려면 주입 시간 동안 펌프를 5μL/min으로 설정하십시오. 시스템에 기포가 없는지 확인하십시오. 튜빙이 모든 연결부에 데드 스페이스 없이 어댑터에 닿는지 확인합니다.
      4. 위에서 설명한 대로 동물에게 사용할 준비가 되었는지 프로브를 테스트합니다(5.2.1.5).
      5. 참고: 어떤 이유로 프로브가 작동하지 않으면 변경하십시오. 이러한 경우, 미세 투석-EEG 워크스테이션 근처에서 사용할 수 있도록 준비된 몇 가지 미세 투석 프로브를 보관하십시오. EEG 케이블에서 동물을 분리하고 변화를 깨닫기 위해 필요한 경우 이소플루란으로 잠시 마취합니다.
      6. Ringer의 용액으로 채워진 주사기의 FEP 튜브를 각 동물의 프로브의 입구 캐뉼라에 연결하고 출구 끝에 액체 방울이 나타날 때까지 기다립니다.
      7. 프로브의 배출구를 FEP 튜브에 연결하면 시험관에 수집됩니다. 구멍이 뚫린 캡으로 닫힌 0.2mL 시험관에 FEP 튜브를 삽입합니다. 모델링 점토 조각으로 고정하여 튜브가 제자리에 유지되는지 확인합니다.
      8. 시스템 평형을 이루기 위해 샘플을 수집하지 않고 60분 동안 2μL/분으로 펌프를 계속 실행합니다(샘플 제로).
      9. 기준선 조건(일반 Ringer's solution을 사용한 관류)에서 30분 투석액 시료 5회(각 용량 60μL)를 연속으로 수집합니다. 얼음에 샘플을 보관하십시오.
      10. 액체가 펌프에서 동물의 머리로 통과하는 데 걸리는 시간(튜브의 데드 볼륨, 즉 기포 시간에 따라 다름)을 계산하고 펌프를 중단하지 않고 이때 일반 Ringer 용액이 들어 있는 주사기에서 수정된 (100 mM K⁺) Ringer 용액이 들어 있는 주사기로 전환하는 FEP 튜브를 전환합니다. 시스템에 기포가 없는지 확인하십시오. 펌프를 10분 동안 작동시킵니다. 주의: 10분 동안 높은 K⁺ 자극을 받으면 동물은 미친 듯이 움직이는 경향이 있으며 일반적으로 많은 수의 젖은 개 흔들림(대조군 및 발작 클러스터 동물) 또는 행동 발작(간질 동물)을 나타내므로 튜브와 케이블이 꼬이지 않도록 보호하기 위해 개입할 준비를 하십시오.
      11. 10분 후 100mM K⁺ Ringer 용액이 들어 있는 주사기에서 일반 Ringer 용액으로 튜브를 전환하고 펌프를 작동시킵니다. 용액이 교체되는 동안 펌프를 끄지 마십시오., 일렬로 연결할 튜브 끝에 액체가 한 방울 떨어지도록.
      12. 투석액에 높은 칼륨이 함유된 순간부터, 즉 다섯 번째 평형 후 투석액을 채취한 후부터 1시간 동안 10분(20μL)마다 투석액 분획을 수집합니다. 30분 투석액 검체 3개를 추가로 수집하고 펌프를 정지합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오.
      13. 실험 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석이 완료될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
      14. 급성(24시간) 및 첫 번째 발작 그룹을 제외하고 3일 연속으로 미세투석 실험을 반복하며, SE 후 24시간 후 또는 첫 번째 자연 발작 후 24시간 이내에 한 번의 미세투석 세션만 진행됩니다(그림 3).

결과

그림 1. 이식할 장치의 단계별 준비.(A) 왼쪽의 보호 슬리브에 10cm 길이의 접지 전극이 있는 3채널 전극, 장치 조립에 필요한 오른쪽의 미세 투석용 가이드 캐뉼라. (B). 벌거벗은 전극 및 가이드 캐뉼러를 자세히 설명합니다. 첫 번째 단계는 플라스틱 더미에서 금속 가이드 캐뉼라를 제거(C)하고 삽입(D)하여 동물의 머리에 이식된 후 쉽게 방출되도록 하는 것입니다. 두 번째 단계는 투석 가이드 캐뉼러(E, F)에 정렬되도록 꼬인 등록 전극...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3채널 2연전극	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	재질
가이드 캐뉼러	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	재질
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, 프랑스 툴루즈	221300288 (AIC)	솔루션
자일라진	이탈리아 밀라노 시그마	X1251	재료
Isoflurane-vet	Merial, 툴루즈, 프랑스	103120022 (AIC)	솔루션
Altadol 50 mg/ ml - 트라마돌	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	솔루션
Gentalyn 0.1% crm - 겐타마이신	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	재료
심플렉스 급속 치과 시멘트	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	재료
GlasIonomer CX-Plus Cement	일본 교토 쇼후	PN1167	재료
프로브 클립 홀더	Agn Tho's, 스웨덴 린디괴	p/n 100 5001	장비
히스토아크릴®릴 블루 국소 스킨 접착제	TissueSeal, 미국 미시간주 앤아버	TS1050044FP	재료
발륨 10 mg/2 ml - 디아제팜	로슈, 이탈리아 몬차	019995063 (AIC)	재료
25G 바늘이 있는 1mL 주사기	베트로테크니카, 파도바, 이탈리아	3	재료
쥐 유연한 수유 바늘 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	재료
Grass Technology 장치	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	장비(AS40 증폭기, 헤드 박스, 상호 연결 케이블, 텔레팩터 모델 RPSA S40)
모듈식 데이터 수집 및 분석 시스템 MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	장비
디지털 비디오 감시 시스템	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	장비
미세투석 프로브	Agn Tho's, Lindigö 스웨덴	MAB 4.15.1.Cu	재료
미세투석 프로브	Synaptech, 콜로라도 스프링스, 콜로라도, 미국	S-8010	재료
블록 히터	그랜트 기기, 영국 케임브리지	QBD2	장비
교반기	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	장비
주입 펌프	Univentor, Zejtun, Malta	864	장비
미세 보어 폴리에틸렌 튜빙	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö 스웨덴	1002	재료
빨간색 튜빙 어댑터	Agn Tho's, Lindigö 스웨덴	1003	재료
2.5mL 주사기와 22G 바늘	Chemil, 파도바, 이탈리아	S02G22	재료
바이알 캡	크로노스, 라비콤, 올로모우츠, 체코	VCA-1004TB-100	재료
격막	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL 격막	재료
바닥 스프링이 있는 유리 인서트	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	재료
자동시료주입기 바이알	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, 이탈리아 몬차	C4013-2	재료
Smartline Manager 5000 시스템 컨트롤러 및 탈기 장치	Knauer, Berlin, Germany	V7602	장비
Smartline 1000 4차 그래디언트 펌프	Knauer, 독일 베를린	V7603	장비
링거 용액	mM 단위의 구성: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		솔루션
수정된 링거 용액	mM 내 구성: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		용액
식염수	0.9% NaCl, ph 7.0		용액
자당 용액	증류수 중 10% 자당		솔루션