Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

초록

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)

이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 표본 준비

1. 뇌 고정
   1. Preparation of the fixative
      1. 1L의 경우 파라포름알데히드 10g의 무게를 달고 탈이온수 300ml(H₂O)에 첨가합니다. 연속 교반으로 55 - 60ºC에서 ~10분 동안 가열합니다.
      2. 불을 끄고 4 N 수산화나트륨(NaOH) 7 - 8방울을 넣으십시오. 해결책은 ~ 10 분 안에 명확 해집니다.
      3. 실온 또는 RT로 식히고 피크르산 포화 용액 150ml를 넣고 탈이온화 H_2O로 500ml에 넣습니다.
      4. 0.2M 인산염 완충액(PB) 500ml를 추가합니다. 여과지로 필터링합니다. NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다.
      5. 정착액을 6ºC로 식히고 6ºC에서 하루 이상 어두운 유리병에 보관하십시오.
   2. Transcardiac perfusion
      1. 티오펜탈(체중 120mg/kg)의 복강내 주사로 마우스를 마취합니다. 동물이 없어야 하는 페달 철수 반사를 확인하여 동물이 깊이 마취되었는지 확인하십시오. 동물을 네 팔다리를 묶은 관류 테이블 위에 등을 대고 놓습니다.
      2. 뭉툭한 가위로 복벽을 세로로 열고 흉곽의 꼬리 경계를 따라 측면으로 두 번 더 잘라 횡격막을 노출시킵니다. 횡격막을 잘라내고 양쪽의 골연골 경계에서 흉벽을 자릅니다. 흉골을 포함하는 흉벽의 중앙 슬래브의 꼬리 끝을 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
      3. 심낭을 제거하고 좌심실 끝을 작고 정밀하게 절개하여 관류 장치의 캐뉼라를 수용합니다. 내경이 0.6mm인 뭉툭한 캐뉼라를 사용하십시오. 끝이 상행 대동맥에 나타날 때까지 캐뉼러를 심실을 통해 부드럽게 통과시키고 클램프로 캐뉼라를 고정합니다. 혈액과 관류물이 혈류에서 빠져나갈 수 있도록 우심방을 절개하십시오.
      4. 인산염 완충액 식염수 또는 PBS(25mM, 0.9% 염화나트륨 또는 NaCl, pH 7.4)를 사용하여 처음에는 연동 펌프를 사용하여 약 1분 동안 마우스를 경핵으로 관류한 다음 7분 동안 얼음으로 냉각한 정착제를 사용합니다.
      5. 고정 후 가위로 마우스 머리를 절단 한 다음 목에서 코까지의 정중선을 통해 피부를 자릅니다. 두개골이 완전히 드러나도록 근육을 제거합니다.
      6. 날카로운 가위를 사용하여 foramen magnum에서 시작하여 후두골과 두정간골을 세로로 자릅니다. 가는 핀셋을 사용하여 이 뼈를 제거하여 소뇌 전체를 노출시킵니다. 그런 다음 두정골과 전두골을 코뼈까지 세로로 자르고 핀셋으로 제거하여 뇌 전체를 노출시킵니다.
      7. 주걱을 사용하여 뇌를 손상시키지 않고 제거하고 얼음처럼 차가운 0.1M PB에 넣습니다.
2. 표본의 절편 및 다듬기
   1. 관심 영역이 포함된 면도날로 약 5 - 6mm의 관상 블록을 자릅니다. 시아노아크릴레이트 접착제로 바이브로슬라이서 홀더에 붙입니다. 신피질이 진동하는 칼날을 향하도록 조직 블록의 방향을 지정합니다. 바이브로슬라이서(그림 1A)를 사용하여 편도체를 포함하는 코로나 절편을 얼음처럼 차가운 0.1M PB에서 140μm로 절단하고 동일한 완충액의 6웰 접시에 수집합니다.
   2. 실체현미경으로 슬라이스에서 관심 영역(여기서는 편도체 또는 ITC의 삽입된 세포 덩어리의 중앙-등쪽 주위낭 클러스터, 그림 1B 참조)을 잘라냅니다. 안과용 메스를 사용하여 실리콘 엘라스토머로 코팅되고 0.1M PB로 채워진 페트리 접시에서 이 작업을 수행합니다. 트리밍된 블록이 스페이서의 구멍(약 1.5mm)에 맞는지 확인합니다(그림 1B).
   3. 트리밍된 블록을 6ºC에서 하룻밤(O/N) 동안 동결 보호 용액(0.1M PB의 30% 글리세롤)으로 이동합니다.

2. High-Pressure Freezing

참고: FRIL(Freeze-fracture Replica Immunolabeling)은 6가지 필수 단계(그림 2)로 구성됩니다: 1) 시편의 고압(2,300 - 2,600bar)으로 급속 동결. 2) 시편의 파괴. 파괴면은 일반적으로 얼어붙은 막의 중앙 소수성 코어를 따라 두 개의 반막 전단지, 즉 원형질에 인접한 반쪽(P-face)과 세포외 또는 외형질 공간(E-face)에 인접한 반쪽으로 나뉩니다. 3) 백금과 탄소의 진공 증착에 의한 표본의 복제. 4) 세제 - 조직의 소화. 5) 면역금 라벨링. 6) 투과전자현미경을 이용한 복제품 분석.

1. 구리 캐리어 준비
   참고: FRIL 절차의 연속 단계를 통해 처리하려면 시편을 금속(금 또는 구리) 캐리어에 장착해야 합니다. 이러한 캐리어는 파쇄 모드와 사용되는 기계 유형에 따라 크기와 디자인이 다릅니다. 여기에서 우리는 구리 캐리어(그림 1B, E)와 힌지가 있는 "이중 복제 테이블"(그림 3B 참조)을 사용했으며, 이를 열면 얼어붙은 시편을 통해 인장 파괴가 발생합니다(그림 2). 이를 통해 파쇄된 시편의 양면을 유지하고 복제할 수 있습니다.
   1. 샤모아 스킨 시트를 사용하여 변색 제거제로 구리 캐리어를 연마합니다.
   2. 유리 냄비에 캐리어를 넣고 초음파 수조에서 비이온 세제(pH ~1.5)로 두 번 세척한 다음 수돗물로 광범위하게 세척한 다음 탈이온수로 세척한 다음 에탄올로 두 번 헹굽니다.
   3. 구리 캐리어를 아세톤에서 15분 동안 초음파 처리합니다.
   4. 캐리어를 여과지에 올려 말리십시오.
   5. 양면 테이프 링을 구리 캐리어(그림 1C)에 부착하면 트리밍된 블록(홀딩 캐리어)의 고정 웰 역할을 합니다.
2. 표본 동결
   참고: 액체 질소를 주의해서 다루고 적절한 고글을 착용하십시오.
   1. 표본을 동결하기 전에 최소 1.5시간 동안 고압 냉동 장치(그림 1F)를 켭니다.
   2. "AIR HEATER" 버튼을 눌러 가열을 시작하고 50분 동안 굽습니다. 공기 온도를 80°C로 설정합니다.
   3. 질소 탱크를 고압 냉동 장치에 연결하고 "NITROGEN" 버튼을 눌러 내부 듀어를 액체 질소로 채웁니다. "질소 수준" lamp 불이 들어옵니다. "냉각" 버튼을 눌러 냉각을 시작합니다.
   4. "NITROGEN LEVEL"이 꺼지면 "DRIVE IN" 버튼을 누르십시오. 유압 시스템이 피스톤을 앞뒤로 3번 움직이는지 확인하십시오.
   5. "AUTO" 버튼과 "NITROGEN" 버튼을 누릅니다. "READY"가 켜지면 고압 냉동 장치가 고압 동결 준비가 된 것입니다.
   6. 유리 피펫에 녹은 백금 와이어 루프를 사용하여 트리밍된 블록을 양면 테이프(그림 1B)의 구멍에 놓습니다.
   7. 여과지나 브러시를 사용하여 과도한 동결 보호 용액을 제거합니다.
      참고: 이 절차는 조직 주위에 형성될 수 있고 조직 모양 및/또는 미세 구조의 뒤틀림을 유발할 수 있는 기포를 제거하는 데에도 중요합니다.
   8. 실체현미경 아래에서 고정 캐리어를 다른 캐리어로 덮어 조직 블록이 두 캐리어 사이에 끼워
   지도록 합니다.
   9. 캐리어 샌드위치를 고압 냉동 장치의 시편 홀더에 삽입합니다(그림 1D). 시편 홀더를 고압 냉동 장치에 삽입하고(팁 아래로) 시편 홀더를 나사로 조여 고정합니다.
   10. "Jet-Auto" 버튼을 눌러 동결 과정을 시작합니다. 가능한 한 빨리 작업하여 시편 홀더를 제거하고 팁을 액체 질소와 함께 절연 상자에 담그십시오. 두 쌍의 집게 끝을 액체 질소에 담그어 식힙니다.
   11. 표본 홀더에서 캐리어 샌드위치를 조심스럽게 제거하고 미리 식힌 냉동 장치에 넣습니다. 캐리어가 액체 질소 냉각 집게로만 취급되는지 확인하십시오. 질소가 바이알에서 흘러나올 수 있도록 극저온 여과에 구멍을 뚫어야 합니다(그림 1G).
   12. 원하는 모든 샘플이 얼 때까지 2.2.6에서 2.2.11까지의 단계를 반복합니다. 동일한 유형의 시료를 포함하는 여러 캐리어 샌드위치를 동일한 바이알에 보관할 수 있습니다.
   13. 복제될 때까지 캐리어를 포함하는 cryovials를 cryotank에 보관합니다(그림 1H).

3. 동결 파괴 및 복제

1. 전자빔 건의 준비
   1. 전자빔 건을 삽입하기 전에 "디플렉터 플레이트"로 실드를 제거하십시오. "설정 게이지"를 배치하여 필라멘트를 하부 음극 커버를 통해 콜릿 척의 중앙에 놓습니다.
      참고: 설정 게이지의 더 큰 직경 끝은 탄소 총에 사용되고 더 작은 직경 끝은 백금 총에 사용됩니다.
   2. "압력 층"이 필라멘트의 끝을 cl 수 있을 때까지 새 필라멘트를 게이지 위로 밀어 필라멘트 코일이 비스듬히 놓이지 않도록 합니다.
   3. 설정 게이지를 제거하고 카본 로드를 삽입합니다. 증발기 로드 홀더의 콜릿 척을 조여 로드 끝의 높이가 바닥에서 두 번째 코일의 중간에 오도록 하여 고정합니다. 백금 건의 경우 백금 막대 끝의 높이는 상단에서 두 번째 필라멘트 코일의 중간에 있어야 합니다.
   4. 디플렉터 플레이트를 교체하고 동결 파괴 장치에 건을 삽입합니다. 사용 후에는 샌드 블라스터로 총을 청소하십시오.
2. 동결-파괴 단위 설정
   1. MAINS를 1로 설정하여 동결 파괴 장치(그림 3A)를 켭니다. 동결-파괴 및 복제 절차에 대한 자세한 설명은 제조업체에서 제공하는 사용 설명서를 참조하십시오.
   2. 동결 파괴 장치를 냉각하기 전에 따뜻한 공기로 장치의 전체 냉각 시스템을 굽습니다. MTC 010 장치(온도 제어 장치)(그림 3A)의 "해동" 버튼을 누르고 베이크 아웃 프로세스를 45분 동안 실행합니다.
   3. 진공 스테이션을 활성화합니다. 동결 파괴 장치는 일반적으로 ~^10-6 - ^10-7mbar의 진공 범위에서 작동합니다.
   4. 질소 탱크를 채우고 동결 파괴 장치에 연결합니다. 밸브 홀더가 건조한지 확인하고 밸브 홀더를 삽입하기 전에 탱크 입구도 청소하십시오(습도는 진공 및 탱크의 N₂ 충전 표시를 방해할 수 있음).
   5. 온도를 -115 °C로 설정하여 냉각을 시작합니다. 냉각에는 약 45분이 걸립니다.
   6. 전자빔 건을 삽입하고 증발을 위한 다음 매개변수에 도달하도록 전류와 전압을 조정합니다.
      카본 건: 회전 켜짐, 위치 90°, 탄소 축적 속도 0.1 - 0.2 nm/sec
      탄소-백금 건: 회전 꺼짐, 위치 60°, 축적 속도 0.06 - 0.1 nm/sec
      참고: 탄소 또는 백금 막대를 교환한 후 건을 처음 사용하는 경우, 사용하기 전에 3분 동안 가스를 제거하십시오.

3. 파쇄와 복제

   1. 냉동 캐리어 샌드위치를 이중 복제 테이블에 삽입하여 모든 조작이 액체 질소에서 수행되었는지 확인합니다.
   2. 이중 복제 테이블을 듀어 선박으로 옮기고 45° 각도로 표본 스테이지 수신기에 고정합니다. 액체 질소 수준은 항상 이중 복제 테이블보다 높아야 합니다.
   3. 테이블 조작기로 이중 복제 테이블을 집어 들고 동결 파괴 장치에 삽입하십시오.tage. 이중 복제 테이블의 온도가 -115°C로 조정될 때까지 약 20분 정도 기다립니다.
   4. 진공이 ^10-6mbar 미만이고 온도가 -115°C인지 확인하십시오.
   5. 이중 복제 테이블 위에 놓인 슈라우드에 연결된 휠을 수동으로 시계 반대 방향으로 회전하여 조직을 골절시킵니다. 슈라우드가 회전하면 이중 복제 테이블이 강제로 열려 조직이 파괴됩니다.
   6. 동결 파괴 장치의 EVM 030 장치(전자빔 증착 제어 장치)에 있는 "고압" 버튼을 누릅니다(그림 3A).
   7. 5nm 두께에 대해 90° 각도로 배치된 전자빔 건을 사용하여 탄소를 증발(회전)한 다음 2nm 두께에 대해 60° 각도로 백금-탄소를 사용한 단방향 그림자를 사용하여 파쇄된 조직의 노출된 표면(그림 3C)을 복제합니다. 마지막으로 15nm 두께의 탄소 층을 90° 각도(회전)로 적용합니다.
   8. 증발을 위해 다음 매개변수를 사용하십시오:
      1차 탄소: 회전 켜짐, 위치 90°; 속도 0.1 - 0.2 nm/sec; 5 nm
      2차 탄소-백금: 위치 60°; 속도 0.06 - 0.1 nm/sec; 2 nm
      3차 탄소: 회전 켜짐, 위치 90°; 속도 0.3 - 0.5 nm/sec; 15 nm
   9. 동결 파괴 장치에서 복제된 표본을 제거하고 TBS( 트리스 완충 식염수, pH 7.4).
   10. 백금 루프 선재를 사용하여 표본 캐리어에서 복제된 조직을 제거합니다(그림 4A).
   11. 모든 샘플이 복제될 때까지 3.3.1에서 3.3.10까지의 단계를 반복합니다.

   4. 복제품의 SDS-소화

   1. 복제품을 1ml의 SDS 소화 완충액(2.5% 소듐 라우릴 설페이트, 15mM 트리스의 20% 자당, pH 8.3)으로 채워진 4ml 유리 바이알로 옮깁니다. 흔들면서 80°C에서 18시간 동안 분해합니다(45회/분).
   2. SDS-digestion buffer로 채워진 새 튜브로 복제본을 옮기고 RT에 보관합니다.

4. Immunolabeling

참고: 항체를 사용한 배양을 제외한 모든 배양은 RT에서 부드럽게 흔들어 수행됩니다.

1. 신선한 도데실황산나트륨(SDS)-소화 버퍼에서 복제품을 10분 동안 세척합니다.
2. Tris-Buffered Saline 또는 TBS에 2.5% BSA(소 혈청 알부민)를 넣어 복제품을 5분 동안 한 번 세척한 다음 TBS에 0.1% BSA를 넣어 10분 동안 3회 세척합니다.
3. TBS에서 5% BSA로 1시간 동안 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
4. 2% BSA-TBS에 희석된 1차 항체를 적용합니다. 15°C의 습한 챔버에서 72시간 동안 30μl 낙하(그림 4B)로 인큐베이션을 수행합니다(그림 4C).
   1. 이 연구에서는 골절된 조직에서 두 복제본을 모두 처리합니다. 모든 α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid Receptor 또는 AMPA-R subunit(희석: 1:200)에 공통적인 마우스 GluR1의 아미노산 717 - 754에 대해 생성된 기니피그 다클론 항체 또는 N-Methyl-D-Aspartate 수용체의 NR1 서브유닛의 아미노산 660 - 811 또는 NMDA-R(희석: 1:500), 및 녹색 형광 단백질에 대항하여 제기된 토끼 다클론 항체(희석: 1:300).
   2. 랫μ-오피오이드 수용체의 아미노산 384 - 398에 해당하는 합성 펩타이드에 대해 제기된 토끼 다클론 항체로 다른 복제본을 배양합니다(희석: 1:500).
5. 0.05% BSA로 TBS에서 세척합니다(3 x 5분).
6. 2차 항체를 적용합니다. 이 연구를 위해 TBS에 2% BSA로 희석된 금(이온성 글루타메이트 수용체의 경우 5nm, μ-오피오이드 수용체의 경우 10nm 및/또는 Channelrhodopsin-2 Yellow Fluorescent Protein 또는 ChR2-YFP)의 경우 15nm)를 사용합니다. 2차 항체를 1:30으로 희석하고 15°C O/N에서 30μl 적하로 배양합니다.
7. RT에서 0.05% BSA-TBS로 3 x 5분 세척합니다.
8. 초순수로 2 x 5 분 씻으십시오.
9. formvar 코팅된 100라인 평행 막대 그리드에 복제본을 장착합니다(그림 4D).

결과

그림 1. 조직 준비 및 고압 동결. (A) Vibroslicer는 조직을 절단하는 데 사용됩니다. (B) 그 결과 편도체를 포함하는 관상 생쥐 뇌 부분이 양면 테이프 링이 장착된 구리 캐리어와 나란히 표시됩니다. 점선 상자는 ITC의 medial paracapsular cluster를 포함하는 관심 영역을 나타냅니다. 양면 테이프의 구멍 직경은 약 1.5mm입니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tissue preparation
파라포름알데히드 EM grade	Agar Scientific Ltd., United Kingdom	AGR1018
포화 피크르산 용액	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Germany	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Germany	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germany	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultrapure water system	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
연동 펌프	ISMATEC, Germany	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Germany	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Ophthalmic scalpel	Alcon Laboratories, USA
perfusion cannula	Vieweg, Germany	F560088-1
High-pressure Freezing
Copper carriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol 폴란드어	Henkel, Germany
Chamois skin	Household supply store
Hole punch, 1,5mm	Stubai, Austria
Denatured 에탄올	Donauchem, Austria
Acetone	Roth, Germany	9372.5
고압 냉동 기계 HPM 010	BalTec, CH; 현재 Leica Microsystems	HPM010
Stereo-Microscope	Olympus, Japan	SZX10
액체 질소
Cryo-vials	Roth, Germany	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
액체 질소 저장 용기	Cryopal, 프랑스	GT38
Non-ionic detergent (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Germany
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	SANDURET 2- K
Siliciumcarbid SIC 360, 입자 크기 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
Freeze Fracture System BAF 060	BalTec, CH; now Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 well plate	오스트리아 그뢰펠	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
염화나트륨	머크, 독일	1,06,40,41,000
SDS, 소듐 라우릴 설페이	Roth, Germany	5136.1
Sucrose	Merck, Germany	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, 독일	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany	7001-0050
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anti-GFP 항체	Molecular Probes, USA	A11122
안티-팬-AMPAR 항체	프론티어 연구소, 일본	pan AMPAR-GP-Af580-1
안티-NMDAR1 항체, 클론 54.1	머크 밀리포어, 독일	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA	24216
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody	BBInternational,	EM. GAG5
EM 염소 anti-rabbit, 15nm; 2차 항체	BBInternational,	EM. GAR15
당나귀 anti-rabbit, 10nm, 2차 항체	AURION, Netherlands	DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator	Major 과학, 미국	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1

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