ALS 마우스 모델에서 동시 혈량측정(Plethysmography and Electromyography recording in an ALS mouse model)

초록

출처: Jensen, V. N., et al. 신경근 질환의 마우스 모델에서 호흡기 근육 활동 및 환기의 반복 측정. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 자유롭게 움직이는 ALS 마우스 모델에서 동시 혈량측정과 근전도 신호를 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 시술에는 이식된 전극과 송신기를 사용하여 근육 활동을 캡처하고, 혈량측정실을 사용하여 호흡 패턴을 모니터링하여 ALS 쥐에서 보조 근육의 역할을 조사하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술

1. 을 위한 마우스 준비이식을 위해 원하는 마우스(예: SOD1(G93A) 또는 대조군)을 선택하고 동물의 무게를 잰다.
   참고: 이 수술을 받는 마우스(수컷 또는 암컷)의 권장 연령과 체중은 각각 P56 - P120 및 ≥ 24g입니다.
2. 2L/min 산소 유속으로 3.5% 이소플루란 이하의 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기와 꼬리 꼬집기를 수행하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
3. 수술 중 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 윤활제 안과 연고를 바르십시오.
4. 귀와 어깨 사이의 수술 부위를 노출시키기 위해 마우스를 면도합니다(그림 1C).
5. 발톱을 수술 부위에 동측으로 잘라 쥐가 리드를 뽑거나 치유 과정에서 긁어서 상처를 입을 가능성을 줄입니다.
6. 먼저 소독제로, 그 다음에는 이소프로판올로 수술 부위를 번갈아 닦습니다. 2회 더 반복합니다.

2. scalene 및 trapezius 근전도(EMG) 활동을 기록하기 위해 원격 측정 장치 이식

1. 해부 현미경 아래, 가열 패드를 덮고 있는 멸균 패드 위에 동물을 옆으로 눕히고 테이프로 콧방울을 제자리에 고정합니다. 심장에서 오는 심전도(ECG) 신호를 줄이기 위해 오른쪽에 이식하는 것이 가장 좋습니다.
   참고: 호흡을 모니터링하고 필요한 경우 이소플루란 수치를 조정하여 규칙적인 호흡수와 적절한 마취 수술 평면을 유지하십시오.
2. 몸통을 따라 앞다리를 동측 발 쪽으로 당깁니다.
   참고: 이 위치는 견갑골을 꼬리 쪽으로 이동시켜 비늘 근육과 승모근에 외과적 접근을 제공합니다.
   1. 뭉툭한 곡선의 집게를 잡고 앞발을 수술 부위에 동측으로 붙인 다음 발을 제자리에 테이프로 붙입니다(그림 1C). 강력한 접착식 수술 테이프를 사용하여 시술 기간 동안 발이 고정되어 있는지 확인하십시오.
3. 새 수술용 장갑을 끼십시오. 메스를 사용하여 어깨와 귀 사이를 약 2cm 길이의 비스듬히 절개합니다(그림 1C의 빨간색 선).
4. 양손에 하나씩 두 개의 #2 후판 절제술을 사용하여 지방 패드를 뒤로 당기고 승모근과 판형근을 벌려 흉쇄유돌근과 비늘근을 덮고 있는 근막을 노출시킵니다(그림 1D 및 E).
5. 창백한 흉쇄유돌근과 횡격돌근을 경계표로 사용하여 비늘 근육을 식별합니다. 횡격막 신경은 비늘 근육과 평행을 이루는 반면 흉쇄유돌은 열등합니다. 비늘 근육은 경추에서 승모근 아래의 갈비뼈까지 비스듬히 뻗어 있습니다. 생체전위 리드는 횡격신경에 인접한 근육으로 식별될 수 있는 전방 스케일렌 근육에 삽입됩니다(그림 1F 및 G).
   참고: 주의. 이 부위는 혈관이 많이 형성되어 있어 쇄골하 동맥이 절단되지 않도록 주의해야 합니다. 횡격막 신경과 상완신경총의 손상을 피하십시오.
6. 비늘 근육과 승모근이 확인되면(그림 1G), 견갑골 사이의 동물 뒤쪽에 송신기를 위한 피하 주머니를 만드십시오.
   1. 조직 분리 가위를 사용하십시오. 뭉툭한 팁을 피부 바로 아래에 삽입하고 송신기 너비의 약 1.25배에 해당하는 주머니 구멍이 형성될 때까지 벌립니다(그림 1H).
      참고: 송신기는 최소한의 저항으로 삽입해야 하지만 포켓은 송신기가 스스로 움직일 수 있을 정도로 커서는 안 됩니다. 주머니가 너무 작으면 송신기가 피부에 문질러 동물이 피부를 긁거나 리드를 빼낼 수 있는 자극을 유발할 수 있습니다. 주머니가 너무 크면 장액이 형성되거나 송신기가 바람직하지 않은 위치로 이동할 수 있습니다.
7. 따뜻하고 멸균된 식염수로 씻어내고 근육에 더 평평한 면이 닿도록 송신기를 삽입합니다. 송신기가 평평하게 놓이고 전선이 꼬이지 않고 서로 평행하게 포켓에서 나오도록 배치합니다(그림 1I). 장치 아래의 과도한 길이의 와이어를 말리고 평평하게 놓습니다.
8. 송신기에서 스케일렌 및 승모근까지 리드를 실행하여 두 세트의 이중 전위 리드가 서로 평평하고 평행하게 놓이
도록 합니다.
9. 후판 절제술을 사용하여 전방 스칼렌을 주변 근육과 분리하고 스칼렌 근육을 통해 근육 섬유에 수직인 25게이지 바늘을 삽입합니다.
   1. 바늘 끝에 하나의 리드를 삽입한 다음 근육에 삽입된 리드를 와이어의 절연체까지 남겨두고 근육에서 바늘을 빼냅니다(그림 1J 및 K). 어떤 색깔의 리드가 어떤 근육에 삽입되었는지 기록합니다.
10. 리드가 삽입되는 근육에 가까운 와이어의 노출된 끝 부분에 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 리드 캡과 근육 사이에 와이어가 노출되지 않도록 리드 캡을 와이어 위로 빠르게 밀어 넣습니다(그림 2A 및 B).
    참고: 시아노아크릴레이트로 EMG 리드를 고정하는 것이 허용되는 관행이지만 다른 방법은 리드 캡 주위에 실크 봉합사 매듭을 묶는 것입니다.
11. 동일한 단계(3.10-3.12단계)를 따라 첫 번째 리드에서 1 - 2mm 떨어진 동일한 근육에 첫 번째 극성 리드와 평행하게 삽입합니다.
12. 3.10 - 3.12단계를 반복하여 비늘 근육 바로 앞에 위치한 승모근에 리드를 삽입합니다(그림 1L 및 M).
13. 철사 리드가 제자리에 고정되어 있고 동물이 철사를 당기지 않고 몸의 움직임을 수행할 수 있을 만큼 충분한 여유가 있는지 확인하십시오. 과도한 길이의 납이 피부를 밀지 않도록 하십시오. 이는 동물이 납을 긁거나 잡아당기게 할 수 있는 자극을 유발할 수 있으므로 주의하십시오. 잠재적인 불편함을 방지하기 위해 필요한 경우 리드의 위치를 조정하십시오.
14. 앞다리를 잡고 있는 테이프를 부드럽게 제거합니다. 지방 패드를 근육 위로 뒤로 당겨 삽입된 리드를 덮는 데 사용합니다. 절개 부위가 일직선이 되도록 피부 플랩을 다시 함께 묶어 시아노아크릴레이트 접착제로 절개 부위를 닫습니다. 구부러진 집게와 함께 피부 덮개의 일부를 꼬집고 이 선을 따라 작은 선의 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다.
15. 참고: 수술 후 1-2일 동안 하루에 한 번 0.1mL의 카프로펜을 계속 투여하고 그 후 필요에 따라 투여하십시오.
16. 노즈콘에서 동물을 꺼내 예열 된 인큐베이터의 깨끗한 케이지에 넣어 깨어나 자발적으로 케이지 주위를 이동할 때까지 놓습니다. 그 후, 최소 15분 동안 동물을 인큐베이터에 머물게 하면서 동물의 움직임과 각성 정도를 모니터링한다.

3. Postoperative Care

1. 수술 후 동물을 따로 수용합니다. 치유하는 동물에게 다이어트 젤과 물병을 제공하십시오.
2. 수술 후 처음 30분 동안 동물을 모니터링합니다. 수술 후 5시간 동안 적어도 한 시간마다 동물을 확인하십시오. 수술 후 며칠 동안은 적어도 하루에 두 번 확인하십시오.
3. 괴사, 절개 부위를 따라 및 임플란트가 포함된 체강 내 감염(즉, 열, 부기 및 발적) 및 장액종 형성을 관찰하십시오.
   참고: 이러한 징후는 수술 후 1주일 이내에 나타납니다. 그림 1N은 수술 후 1개월 후에 건강하고 치유된 동물을 보여줍니다. EMG 기록은 이식 직후 즉시 할 수 있지만, 이식 직후 ECG 신호가 높을 수 있으므로 EMG 및 혈량측정술을 기록하기 전에 동물의 치유를 위해 최소 1주일이 주어집니다.

4. 동시 근전도 및 혈량검사 신호

1. 획득바이어스 흐름을 포함한 모든 수집 장비를 켭니다.
   참고: 마우스의 유속은 일반적으로 1.0L/min으로 설정됩니다.
2. 유량계를 사용하여 혈량계 챔버를 보정합니다.
   참고: 주기적으로 혈량측정 챔버를 점검하여 씰에 금이 가거나 파손되지 않았는지 확인하십시오. 양호한 상태를 유지하려면 일주일에 한 번 진공 그리스와 같은 윤활제로 고무 씰을 코팅하십시오.
3. 제조업체가 지정한 대로 입력 송신기 보정.
4. EMG와 혈량측정법을 기록하기 전에 마우스를 혈량측정실에 최소 1시간 동안 넣어 적응시킵니다. 여러 챔버를 사용하여 다음 마우스가 두 번째 챔버에 적응하는 동안 한 마우스에서 녹음할 수 있습니다. 배터리 전원을 절약하기 위해 적응 기간 동안 송신기를 켜지 마십시오(그림 1O).
5. 녹음하기 전에 (그러나 교정 후), 이식된 동물로부터 1인치 이내에 강한 자석을 배치하여 송신기를 켭니다. 수신기 전면의 빨간색 표시등은 송신기가 켜져 있을 때 나타냅니다.
6. Acquisition"이라고 표시된 풀다운 메뉴를 사용하여 수집을 시작하고 "Start Acquisition"을 선택합니다. 기록 시간은 실험에 따라 다를 수 있지만 일반적인 혈량측정 및 EMG 기록은 1 - 3시간 동안 지속됩니다.
   참고: 송신기의 고유 샘플링 속도는 240Hz입니다. 소프트웨어에서 500Hz의 더 빠른 속도를 설정하여 포인트 사이를 보간하고 더 부드러운 파형을 제공합니다. 임플란트의 저역 통과 필터(안티 앨리어스 필터 역할을 함)와 고역 통과 필터는 이 원격 측정 장치에 대해 1-50Hz 대역폭을 지정합니다. 60Hz A/C 간섭은 임플란트가 배터리로 구동되고 동물이 임플란트를 보호하고 전기장으로부터 리드하기 때문에 EMG 신호의 과도한 잡음에 기여하지 않습니다. 혈량측정, EMG 및 비디오는 획득 소프트웨어를 통해 실시간으로 자동 동기화됩니다.
7. 획득이 완료되면 자석으로 송신기를 끄고 챔버에서 동물을 꺼냅니다.

결과

그림 1. 호흡기 근육 EMG를 측정하기 위한 원격 측정 장치 이식. (A) EMG를 측정하기 위해 두 쌍의 생체 전위 리드가 있는 원격 측정 송신기. 리드는 원하는 길이(하단)로 자르거나 코일을 감아 트랜스미터 아래(상단)에 끼울 수 있습니다. (B) 송신기 리드. (B') 전선을 노출시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Jackson Laboratory	4435
Plethysmography Chamber	Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International	601-1425-001
Telemetry 수신기 (모델 RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001<
바이어스 플로우 펌프(모델 BFL0500)	Data Sciences International	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. 데이터 교환 매트릭스	Data Sciences International	271-0117-001<
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Data Sciences International	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Configured Ponemah Software System	Data Sciences International	PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Universal Amplifier	Data Sciences International	13-7715-59
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Sync Cable	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Flow Meter	Data Sciences International	600-1260-001
F20-EET 스타터 키트에 포함된 자석 및 라디오	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video Camera	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785<
Actril	Minntech Corporation	78337-000<
Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126)	Leica	10-450-508
서보 제어 가습기/유아 인큐베이터	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters	Data Sciences International	270-0124-001
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20<
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	수술
좁은 패턴 집게- 톱니모양/곡선/12cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5cm/6mm Cutting Edge	Fine Scientific Instruments	15124-12
조직 분리 가위 - 스트레이트/블런트/블런트/11.5cm	Fine Scientific Instruments	14072-10
Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	철사 절단 및 못
메스 손잡이 #3	World Precision Instruments	500236
Scalpel Blade	Fine Scientific Instruments	10010-00	리드 캡
Polysorb Braided Absorbable suture	Coviden	D4G1532X	for coiling transmitter leads
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	시아노아크릴레이트 접착제
3 mL Syring Slip Tip - Soft	Vitality Medical	118030055
25G Needle (X2)	Becton Dickinson and Co.	305-145
면 팁 애플리케이터	Henry Schein Animal Health	100-9175
안디스 이지 컷 이발기 세트		Target에서 판매되는 전기 면도기
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404	마취
이소프로필 알코올 70%	Priority Care 1	MS070PC
더마클로르 2% 의료용 스크럽 ( 클로로헥시딘 2%)	Butler Schein	55482
Artificial Tears	Henry Schein Animal Health	48272	Lubricant Opthalmic Ointment
Vacuum grease	Dow Corning Corporation	1597418
Water Blanket	JorVet	JOR784BN

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