자가 혈액 주입에 의한 쥐 모델에서 대량 폰틴 출혈 유도

초록

출처: Tang, X. et. al., 자가 혈액의 이중 주입에 의한 대량 폰틴 출혈. J. Vis. Exp. (2021)

이 프로토콜은 쥐 뇌의 폰틴 부위에 자가 혈액을 제어하여 주입하여 대규모 폰틴 출혈을 모델링하는 방법을 설명합니다. 목적은 국소 압력을 증가시켜 국소적인 뇌출혈을 시뮬레이션하는 것입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Animal and instruments
2. 8주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐의 체중을 측정하십시오. 250 ± 10 g.
3. 주변 온도 25°C, 상대 습도 65%, 12/12시간 명암 주기의 통제된 환경 조건에서 수술 전 최소 7일 동안 쥐를 수용합니다.
4. 제한 없이 음식과 물을 제공하십시오.
5. 악기를 준비합니다(그림 1A-E).

2. 폰

1. 에 혈액을 주입실험에 적합한 체중을 가진 쥐를 선택하기 위해 수술 3일 전에 다시 쥐의 무게를 잰다.
2. 모델링 전 3일 동안 일반 쥐가 쉬지 않고 밸런스 빔을 통과할 수 있도록 하루에 3번 쥐가 밸런스 빔 위를 걷도록 훈련시킵니다.
3. 마취 전에 가열 패드를 37°C로 예열합니다.
4. 입체 프레임의 홀더에 마이크로드릴을 부착합니다.
5. 쥐에게 50mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진을 복강내로 주입합니다. 발가락 끼임 반응이 없을 때까지 기다립니다.
6. 엎드린 자세로 쥐를 입체 프레임으로 운반합니다. 이어바를 외이도 위에 올려 머리를 고정합니다. 주사가 비뚤어지지 않도록 두개골을 수평 위치에 고정합니다(그림 1F).
7. 입구와 출구 포트가 있는 입체 노즈 콘을 통해 이소플루란(97.5% 산소 및 2.5% 이소플루란)으로 마취를 유지합니다.
8. 각막을 촉촉하게 유지하기 위해 눈 연고를 사용하십시오.
9. 마이크로 면도기로 두개골 위의 머리카락을 면도합니다.
10. 표시된 정중선의 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 회전하면서 Entoiodine 수술용 스크럽을 원형으로 바릅니다.
11. 수술용 커튼을 놓습니다.
12. 표시된 정중선을 따라 메스로 절개합니다.
13. 면봉을 사용하여 잠재적인 혈액을 제거하십시오.
14. 두피 피판의 양쪽에 집게 조각을 놓아 두개골을 드러냅니다(그림 1G).
15. 면봉을 0.9% 식염수에 담그고 두개골 뼈에서 결합 조직을 부드럽게 제거하여 결합 조직이 마이크로드릴에 걸리지 않도록 합니다.
16. 마커 펜을 통해 브레그마의 중심점을 원점으로 표시합니다.
17. AP-9.0mm, 위도 0mm에서 마이크로드릴을 사용하여 개두술(직경 1mm)을 수행합니다(그림 2B 및 표 1). 이 지점은 정맥동에 매우 가깝기 때문에 조심스럽게 진행하십시오(그림 1G).
18. 입체 프레임에서 마이크로드릴을 제거합니다.
19. 100μL Hamilton 주사기를 입체택시 홀더에 넣습니다(그림 1K). 주입 펌프 스위치를 켜고 급속 흡입 버튼을 클릭하고 헤파린 용액(100mL 식염수에 희석된 12500U)을 100μL로 흡인한 다음 혈액 응고가 너무 빨리 발생하지 않도록 완전히 배출합니다.
20. 1mL 주사기에 두피 침술을 부착합니다.
21. 꼬리 끝에서 3cm 떨어진 측면 꼬리 정맥에 두피 침술을 삽입하고 150μL의 혈액을 채취합니다(그림 1H).
22. 1mL 주사기에서 두피 침술을 제거합니다.
23. 혈액을 튜브로 옮깁니다(그림 1I).
    참고: 혈액 응고를 방지하기 위해 빠르게 전송합니다.
24. 수술용 장갑을 바꾸세요.
25. 철회 모드를 선택하고, 부피를 100μL로 설정하고, 속도를 200μL/분으로 설정하고, RUN 버튼을 클릭하고, 100μL의 혈액을 Hamilton 주사기로 흡인합니다(그림 1J).
26. Infuse 모드를 선택하고 속도를 1μL/min으로 설정합니다.
27. 끝이 뇌 표면 아래 9.2mm에 도달할 때까지 주사기를 전진시킵니다(그림 2C 및 그림 1L).
28. 실행 버튼을 클릭하여 1μL/분의 속도로 처음 10μL의 혈액을 주입합니다(표 1).
29. 주사를 중지하고 주사기를 20분 동안 제자리에 두어 지주막하 공간으로 혈액이 유입되는 것을 방지합니다.
30. 끝이 뇌 표면 아래 9.0mm에 도달할 때까지 주사기를 집어넣습니다.
31. 잔여 혈액이 완전히 주입될 때까지 1μL/min의 동일한 속도로 주입을 다시 시작합니다.
32. 혈액 역류를 피하기 위해 주사기를 10분 동안 제자리에 두십시오.
33. 뇌에서 주사기를 천천히 제거하십시오.
34. 뼈 시멘트를 사용하여 개두술 구멍을 덮습니다.
35. 시멘트가 마르면 4-0 폴리아미드 봉합사 필라멘트로 상처를 봉합합니다. 3 또는 4 바늘을 꿰매고 나면 2-1-1 표준 수술 매듭을 묶습니다.
36. 감염을 예방하기 위해 쥐에게 페니실린(0.25mL, 4mL 식염수에 희석된 80IU)을 복강내로 주사합니다.
37. 쥐에게 Butorphanol tartrate(2.5mg/kg)를 피하주사하고 수술 후 24시간까지 수술 후 통증을 완화하기 위해 2시간마다 주사를 반복합니다.
38. 마취에서 완전히 회복될 때까지 15분마다 쥐를 관찰합니다. 케이지 아래에 가열 패드가 있는 원래 케이지로 다시 넣으십시오. 희생 제물이 될 때까지 쥐가 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.

표 1: 자가 혈액 주입.

	Mild	Moderate	대규모
Total volume	30 μL	60 μL	100 μL
첫 번째 주입
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; 위도 0; Vert -9.2 mm
volume	10 μL	10 μL	10 μL
속도	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
간격 시간	20	20 min	20 min
Second injection
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; 위도 0; 정점 -9.2 mm		AP -9.0 mm; 위도 0; Vert -9.0 mm
volume	20 μL	50 μL	90 μL
속도	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
바늘 철수 전	10 min	10 min	10 min
AP: 전후 위치		<
위도: 측면
Vert: vertical

분td style='border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>

결과

그림 1: 수술 기구 및 절차. (A) 마취 기계. (B) 수술 기구. (C) 마이크로드릴. (D) 마이크로 분사 펌프. (E) 입체 장치. (F) 두개골 중앙에 선이 표시되어 있습니다. (G) 노란색 화살표는 드릴 위치를 가리킵니다. (H) 꼬리 정맥에서 혈액 배출. (I) 혈액을 Eppendorf tube로 옮깁니다. (J) 해밀턴 주사기에 혈액을 흡인합니다. (K) 해밀턴 주사기를 두개골 구멍으로 전진시킵니다. (L) 자가 혈액의 주입 과정.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100ml 식염수 용액	광동 yixiang	191222201 C1	헤파린 희석제
100μl Microinjector	상하이 가오지		자가 혈액
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	꼬리 정맥
75% Alcohol	산둥 Lierkang		쥐
Adhesive tape	상하이 진중		Surgicl instruments
동물 마취 시스템	RWD	R510-31S-6	마취
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		신경학적 결핍 점수
뼈 시멘트	Shanghai Xinshiji	20180306	Surgicl 기구
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		통증 관리를 위해
전기 두개골 드릴	난징 다윈 생명공학	20180090018	두개골
EP tube	Nantong Surui		자가 혈액 전송
에리스로마이신 아이 크림	Yunnan pharmacy		눈 보호
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	보온
헤파린 나트륨 주입	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	헤파린 희석제
IndoPhors	Guoyao of China	<
Isoflurane	RWD	20080701	마취
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	자가 혈액 주입
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	중국의 Guoyao		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
두피 바늘	Jiangxi Hongda	20200313	꼬리 정맥
Scalpel	상하이 Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
깎는 가위	상하이 진중	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	외과적 포지셔닝
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	상하이 진중		Surgicl instruments
봉합 가위	상하이 진중	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding junps	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments

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