산소-포도당 결핍 및 재산소화가 세포-세포 상호작용에 미치는 영향

초록

출처: Alluri, H., et.al. 혈액-뇌 장벽 기능 장애를 연구하기 위한 체외허혈-재관류 손상 모델로서의 산소-포도당 결핍 및 재산소화. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 저산소 및 영양 결핍 상태를 시뮬레이션하여 산소-포도당 결핍 및 그에 따른 재산소화가 쥐의 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)에 미치는 영향을 보여줍니다. 이러한 상태는 ATP 고갈, 세포 내 칼슘 증가, 반응성 산소종(ROS)의 생성을 초래하여 세포 접합 단백질을 분해하고 스트레스 섬유 형성을 유도하여 세포 간 상호 작용을 약화시킵니다.

프로토콜

1. 내피 세포의 파종(Seeding)

1. 성체 Sprague Dawley 쥐에서 RBMEC의 1차 배양을 얻습니다(또는 상업적으로 획득).

2. 쥐의 뇌 내피 세포 성장 배지를 사용하여 100cm 피브로넥틴(50μg/ml) 코팅된 페트리 접시에서 RBMEC을 배양합니다. 합류점에 도달할 때까지 2일마다 매체를 변경합니다.

3. 80-90% 농도에 도달하면 5ml의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 소용돌이치며 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 세포를 37°C로 평형을 이루는 따뜻한 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 1ml에 노출시켜 세포를 분리합니다.

4. 세포가 분리되고 분산될 때까지 37°C에서 2-5분 동안 세포를 배양합니다. 참고: 배양 접시를 두드려 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 접시 표면에서 세포가 완전히 분리되었는지 확인합니다.

5. 트립신을 중화하기 위해 페트리 접시에 5ml의 완전한 배지를 추가합니다. 분리된 세포가 포함된 배지를 피펫으로 빼내고 15ml 원심분리 튜브에 수집합니다.

6. 내피 세포가 포함된 배지를 220 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

7. 상등액을 흡입하고 세포를 포함하는 펠렛을 보존합니다. 펠릿을 피펫으로 위아래로 부드럽게 혼합하여 3-5ml의 신선한 쥐 뇌 내피 세포 성장 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

8. 세포 현탁액을 피브로넥틴(50μg/ml) 사전 코팅된 8웰 멸균 챔버 슬라이드 시스템, 웰당 10,000-15,000개 세포 범위의 파종(seeding) 밀도로 0.7 sq. cm/well로 옮깁니다. 합류점에 도달할 때까지 37°C에서 세포를 성장시킵니다 참고: 웨스턴 블롯 또는 기타 실험을 수행하기 위해 실험에 필요한 10cm 세포 배양 접시 또는 특수 접시에서 세포를 성장시킬 수 있습니다.

2. 산소 및 포도당 결핍-재산소화 체외 모델

1. 저산소증 세포 배양 시스템을 사용하여 RBMEC에 대한 OGD-R의 효과를 연구합니다(그림 그림 1 참조). 제조업체의 지침에 따라 실험을 시작하기 전에 저산소증 세포 배양 시스템을 설정하고 보정합니다.

2. 37°C 인큐베이터에서 confluent 챔버 슬라이드(1.8단계)를 제거합니다. 챔버 슬라이드의 전체 배지를 탈산소화되고 포도당이 없는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)으로 교체하고 OGD 상태를 나타내기 위해 37°C에서 2시간 동안 95% 질소 및 5% 이산화탄소로 저산소증 챔버에 넣습니다.

3. 37°C에서 95% 산소, 5% 이산화탄소가 있는 인큐베이터로 세포를 다시 옮기고 신선한 쥐의 뇌 내피 세포를 완전한 배지로 제공하고 37°C에서 1시간 더 배양합니다.

참고: 이 단계는 재산소 상황을 나타냅니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary 항체	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	사용 가능한 다른 PBS는 다음과 같습니다 사용