신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

초록

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018).

이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

프로토콜

1. 네이티브 염색질 면역침전(ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. 파생된 신경구 세포(NS)를 비축한 후, NS가 합류할 때까지 95% 공기와 5%_CO2의 분위기의 조직 배양 인큐베이터에서 37°C의 NSC 배지 15mL에 NS를 T-75 플라스크에 배양합니다. 하나의 합류 T-75 플레이트는 3-5 X 10⁶ 세포를 생성합니다.
   2. 세포가 합류하면 300 x g에서 NS를 5분 동안 원심분리하고 상등액을 디캔팅하고 1mL의 세포 해리 배지를 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 배지 5mL를 추가하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent 2100 Bioanalyzer	애질런트	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, 냉장	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, 칼륨 소금	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A 마그네틱 비드
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	0.1% BSA 및 분취에 20μg/mL 스톡을 준비합니다.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	0.1% BSA 및 분취량에 20μg/mL 스톡을 준비합니다.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	종양 해부<
글리세롤, MB 등급	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	흡입 마취제
ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	셀 분리 미디어
리튬 클로라이드	시그마	L8895	buffer reagent
낮은 바인딩 microtubes	Corning Costar	CLS3207<
microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	각 배치는 다를 수 있습니다. 실험과 부분 표본을 위한 충분한 양을 구입하십시오.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	항균제, 0.1mg/mL에서 사용하십시오.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
킴블 콘테스 펠렛 유봉	Fisher Scientific	K749515-0000
프로테아제 억제제 칵테일	sigma-aldrich	P8340	분취하고 -20 °C에서 보관하십시오.
Protinase K	시그마-알드리치	P2308	물에 10mg/mL 스톡을 만드십시오. -20 °C에서 분취하고 보관하십시오.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	종양 해부<
염화나트륨	VWR	0241-5KG	버퍼 시약
Sodium Deoxycholate	sigma-aldrich	D670-25G	buffer reagent
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르
표준 미니 원심분리기	Fisherbrand	12-006-901	표준 미니 원심분리기
SZX16 microscope	올림푸스	SZX16	형광 해부 현미경
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

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