신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

초록

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018).

이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

프로토콜

1. 네이티브 염색질 면역침전(ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. 파생된 신경구 세포(NS)를 비축한 후, NS가 합류할 때까지 95% 공기와 5%_CO2의 분위기의 조직 배양 인큐베이터에서 37°C의 NSC 배지 15mL에 NS를 T-75 플라스크에 배양합니다. 하나의 합류 T-75 플레이트는 3-5 X 10⁶ 세포를 생성합니다.
   2. 세포가 합류하면 300 x g에서 NS를 5분 동안 원심분리하고 상등액을 디캔팅하고 1mL의 세포 해리 배지를 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 배지 5mL를 추가하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
      참고: 면역침전(IP) 반응당 1 x 10⁶개의 세포가 필요합니다. 사전 면역 혈청 또는 IgG 대조군도 포함되어야 합니다.
   3. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 1개에서 300 x g로 5분 동안 NS를 원심분리하고, 상등액을 디캔팅하고, NS 펠릿을 1mL의 평형 염 용액으로 재현탁하고, 현탁액을 단백질 결합이 낮은 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   4. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기 NS, 상등액을 디캔팅하고 95μL의 소화 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM CaCl₂, 0.2% 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르)에 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 즉시 세포를 위아래로 피펫으로 하여 뭉침을 방지하고 기포가 생성되지 않도록 합니다.
   5. 50% 글리세롤에 미세구균 뉴클레아제(MNase)를 재현탁시켜 "1x" 스톡이라고 하는 1mg/mL 용액(1.15 units/μL, -20 °C에서 보관)을 만듭니다. 50% 글리세롤(예: 900μL의 "1x" MNase 및 100μL의 50% 글리세롤)으로 두 번째 1:9 희석을 수행하여 "0.1x" 스톡을 만들고 -20°C에서 보관합니다.
   6. 5 μL의 "0.1x" MNase와 145 μL의 소화 완충액을 혼합합니다. 효소를 항상 얼음 위에 두십시오. 1 x 10⁶ 세포당 분해 완충액에 5 μL의 희석된 MNase를 추가합니다. 튜브를 튕겨 섞고 튜브를 37°C 블록에 정확히 12분 동안 놓습니다. 12분의 정확한 배양 시간을 보장하기 위해 샘플을 한 번에 하나씩 처리합니다.
   7. 1 x 10 6셀당 10x MNase 정지 버퍼(110mM Tris-HCl, pH 8.0, 55mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA))를 추가합니다. 이 시점부터 샘플은 얼음 위에 보관해야 합니다.
   8. 110 μL "2x Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) buffer" (280 mM NaCl, 1.8% 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르, 0.2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.2% Na-deoxycholate, 5 mM ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA); 4 °C에서 저장) 1 x 10⁶ 세포당 고농도(1:100)로 프로테아제 억제제 칵테일을 보충합니다. 튜브를 튕겨 섞습니다.
   9. 4°C 및 1700 x g의 마이크로원심분리기에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 새로운 일반 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브(저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브는 더 이상 필요하지 않음)로 옮기고 얼음에 보관합니다. 펠릿을 버리십시오.
      
2. Immunoprecipitation (IP)
   1. 단백질 A와 단백질 G 마그네틱 비드를 1:1 비율로 혼합합니다. 모든 IP에 대해 25μL의 비드를 준비합니다.
   2. 1mL의 RIPA 완충액(10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 140mM NaCl, 1% 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르, 0.1% SDS, 0.1% Na-데옥시콜레이트, 4°C에서 보관)을 추가하여 비드를 세척하고 저농도(1:1000)로 프로테아제 억제제를 보충합니다.
   3. 자석을 사용하여 비드가 세척액에서 분리되도록 하고 세척액을 디캔팅합니다(약 1분). 세척 단계를 두 번 수행합니다.
   4. 프로테아제 억제제(1:1000)가 보충된 RIPA 완충액을 사용하여 비드를 원래 부피로 재현탁합니다.
   5. 필요한 경우 프로테아제 억제제(1:1000)가 보충된 RIPA 버퍼를 사용하여 염색질을 희석하여 각 IP의 부피가 100-200μL가 되도록 합니다. 입력을 위해 염색질의 IP당 사용되는 부피의 10%를 예약합니다.
      참고: 예를 들어, IP당 200μL를 사용하는 경우 20μL의 희석된 염색질을 입력용으로 예약해야 합니다. 총 4개의 IP에 대해 총 염색질 부피는 820μL로 희석해야 합니다.
   6. 입력을 준비합니다. 단백질 분해 효소 K (10 mg / mL)가 보충 된 10 μL의 TE 완충액 (8.0 mM Tris-HCl pH 0.5, 0.5 mM EDTA)을 입력에 추가하고 55 ° C에서 1 시간 동안 입력을 배양합니다.
   7. 제조업체의 지침에 따라 중합효소연쇄반응(PCR) 정제 키트를 사용하여 입력값을 정제하고 키트에 제공된 50μL의 용리 완충액에서 용리합니다.
   8. 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 입력의 농도를 측정하고 결과를 노트북에 기록합니다. 키트의 용리 완충액이 있는 블랭크.
      참고: 마우스 신경구에서는 각 IP에 대해 약 6μg의 DNA를 사용했습니다.
   9. 표준 설정을 사용하여 1% 겔에서 입력을 실행하거나 DNA Bioanalyzer에서 1μL를 로드합니다. 나머지는 다운스트림 애플리케이션에서 입력으로 사용하기 위해 저장합니다.
   10. 모든 IP에 대해 10μL의 세척된 단백질 A & G 마그네틱 비드를 추가하고 4°C에서 1시간 동안 IP를 배양합니다.
       참고: 예를 들어, 3개의 IP에 대해 30μL의 단백질 A & G 마그네틱 비드를 추가합니다.
   11. 샘플을 자석에 놓고 구슬이 분리되도록 합니다. 이전에 결정된 양을 새로운 1.5mL 튜브로 옮겨 염색질을 분할합니다.
   12. 항체를 추가하고 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 캡을 감쌉니다. 20rpm으로 회전하면서 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
       참고: 농도는 제조업체 권장 사항에 따라 경험적으로 결정해야 합니다.
   13. 다음날 실온(2000 x g)에서 미니 원심분리기를 사용하여 10초 동안 튜브를 돌립니다. 그런 다음 각 IP에 10μL의 비드를 추가하고 20rpm으로 회전하면서 4°C에서 3시간 동안 IP를 배양합니다.
       
3. IP 세척 및 단백질 소화
   1. 저농도(1:1000)로 프로테아제 억제제가 보충된 RIPA 완충액 150μL를 각 IP에 추가하고 5분 동안 20rpm으로 회전하면서 4°C에서 IP를 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 이 단계를 5회 반복합니다.
   2. 150 μL의 염화 리튬 (LiCl) 완충액 (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 0.5 % Na-deoxycholate, 4 °C에서 보관)을 저농도 (1 : 1000)로 프로테아제 억제제로 보충하고 4 ° C에서 20 rpm으로 5 분 동안 회전하면서 IP를 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
   3. 150μL의 콜드 Tris-EDTA(TE)(프로테아제 억제제 없음)를 추가하고 4°C에서 20rpm으로 5분 동안 회전하면서 샘플을 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 분리되도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
   4. 최종 세척 단계 후 proteinase K(0.5mg/mL)가 보충된 100μL의 TE 완충액에 샘플을 재현탁시키고 55°C에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent 2100 Bioanalyzer	애질런트	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, 냉장	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, 칼륨 소금	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A 마그네틱 비드
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	0.1% BSA 및 분취에 20μg/mL 스톡을 준비합니다.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	0.1% BSA 및 분취량에 20μg/mL 스톡을 준비합니다.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	종양 해부<
글리세롤, MB 등급	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	흡입 마취제
ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	셀 분리 미디어
리튬 클로라이드	시그마	L8895	buffer reagent
낮은 바인딩 microtubes	Corning Costar	CLS3207<
microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	각 배치는 다를 수 있습니다. 실험과 부분 표본을 위한 충분한 양을 구입하십시오.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	항균제, 0.1mg/mL에서 사용하십시오.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
킴블 콘테스 펠렛 유봉	Fisher Scientific	K749515-0000
프로테아제 억제제 칵테일	sigma-aldrich	P8340	분취하고 -20 °C에서 보관하십시오.
Protinase K	시그마-알드리치	P2308	물에 10mg/mL 스톡을 만드십시오. -20 °C에서 분취하고 보관하십시오.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	종양 해부<
염화나트륨	VWR	0241-5KG	버퍼 시약
Sodium Deoxycholate	sigma-aldrich	D670-25G	buffer reagent
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	폴리에틸렌 글리콜 옥틸페닐 에테르
표준 미니 원심분리기	Fisherbrand	12-006-901	표준 미니 원심분리기
SZX16 microscope	올림푸스	SZX16	형광 해부 현미경
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

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