Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

초록

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 혼성화

1. 65°C 세척 완충액 준비: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x 식염수 구연산나트륨), 50%(v/v) 포름아미드 및 0.1%(v/v) Tween-20.
2. MABT 완충액 준비: 100mM 말레산, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.5.
3. 두 개의 프로브(DIG 표지 및 FITC 표지) 1/1,000을 혼성화 완충액(50%(v/v) 탈이온화 포름아미드, 200mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM NaH₂PO₄, 5mM Na₂HPO₄, 0.01 mg/ml 효모 tRNA, 1× Denhardt's solution, 10% w/v dextran sulfate)를 65°C로 예열하고 잘 혼합한다.
4. 각 슬라이드에 약 300μl의 혼성화 혼합물을 적용하고 오븐에서 구운 (200 ° C) 커버 슬립으로 커버 슬립을 적용하고 가습 챔버에서 65 ° C에서 O / N을 배양합니다.
5. 슬라이드를 미리 예열된 세척 버퍼가 들어 있는 Coplin 용기에 옮깁니다. 세척 버퍼로 65°C에서 30분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
6. RT에서 MABT로 10분 동안 슬라이드를 3회 세척합니다.

2. FITC 프로브의 시각화

1. ISH 차단 완충액 준비: 2% 차단 시약과 10% 열 비활성화 양 혈청이 포함된 MABT.
2. 선택 사항: 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 원을 그려 필요한 항체 용액의 양을 줄입니다. 위치
3. 가습된 챔버에서 ISH 차단 버퍼를 사용하여 RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
4. ISH 차단 완충액에서 1/500(v/v)로 희석된 양고추냉이 과산화효소(POD)-공액 항-FITC 항체를 사용하여 4°C에서 슬라이드 O/N을 배양합니다.
5. 0.1%(v/v) Tween-20(PBST)이 포함된 PBS가 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 넣습니다. PBST에서 10분 동안 3회 세척하고 매번 새 PBST로 교체하십시오.
6. 사용 직전에 형광 티라마이드를 증폭 희석액에 100배 희석하여 준비합니다. 이 예에서는 FITC-tyramide를 사용합니다.
7. 이것을 슬라이드에 추가하고 RT에서 10분 동안 그대로 둡니다.
8. 슬라이드를 코플린 병에 넣고 PBST에서 10분 동안 3회 세척합니다.

3. DIG 프로브의 시각화

1. 0.1m Tris-HCl pH 8.2를 준비합니다.
2. RT에서 1시간 동안 ISH 차단 버퍼로 슬라이드를 배양합니다.
3. ISH 차단 버퍼에서 1/1,500(v/v)로 희석된 알칼리성 포스파타제(AP) 공액 항-DIG 항체로 4°C에서 슬라이드 O/N을 배양합니다.
4. MABT로 10분 동안 3회 세척합니다.
5. RT에서 5분 동안 0.1M Tris-HCl pH 8.2로 두 번 세척합니다.
6. 사용 직전에 정제를 0.1M Tris pH 8.2에 용해시켜 Fast Red 용액을 준비합니다. 0.22μM 필터를 통해 용액을 여과합니다.
7. 37°C에서 가습 챔버에서 Fast Red 용액으로 슬라이드를 배양합니다. 최적 발달을 위한 시간이 다양하므로 형광 현미경으로 슬라이드를 정기적으로 확인하여 침전물의 형성을 모니터링하십시오. 이 예에서는 2 - 3시간 후에 반응을 중지합니다.
8. PBST로 10분 동안 세 번 세척합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	65°C 세척 버퍼
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
트윈-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
차단 시약	Roche	11096176001
열 비활성화 양 혈청	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	코스모 바이오	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD 접합 항체	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
마운팅 medium	Dako	S3023
Leica SP2 컨포칼 현미경	Leica
.22 μM 필터	Millex	SLGP033RS
Deionized formamide	Sigma	F9037	ISH 차단 버퍼용
염화나트륨	Sigma	S3014
염산	VWR International	20252.29<
Sodium phosphate monobasic 무수	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435	<
Roche	10109495001
50x Denhardt의 솔루션	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
아세트산나트륨	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

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