젤 내장 환자 유래 질환 섬유혈관 조직의 면역형광 염색

초록

출처: Gucciardo, E., et. al., 증식성 당뇨병성 망막병증의 섬유혈관 합병증에 대한 생체 외 조직 배양 모델. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 피브린 겔에 내장된 섬유혈관 조직의 생체 외 배양에 대한 면역염색 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이를 통해 증식성 당뇨병성 망막병증

과 관련된 혈관 변화를 자세히 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 전체 마운트 면역형광 염색

참고: 이 프로토콜은 5일 동안 지속되며 필요한 경우 야간 배양으로 중단될 수 있습니다. 피브린 젤이 어느 시점에서도 건조되지 않도록 하십시오. 모든 단계는 달리 표시되지 않는 한 RT에서 수행됩니다.

1. 염색 프로토콜을 시작하기 전에 다음 솔루션을 준비합니다.
   1. 고정 후 용액: 동일한 양의 아세톤과 메탄올(예: 50mL)을 혼합하여 50:50 아세톤:메탄올 용액을 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오. 염색 전날에 이 용액을 가장 늦게 준비하십시오. 이 용액은 -20°C에서 다시 보관하고 후속 염색에 사용할 수 있습니다.
      참고: 아세톤과 메탄올은 가연성이며 건강에 해롭기 때문에 흄 후드에 이 용액을 준비하십시오.
   2. Blocking solution: 먼저 PBS에 15% FBS를 첨가하여 PBS에 15% 소 태아 혈청(FBS), 0.3% 옥틸 페놀 에톡실레이트 용액을 준비합니다. 옥틸 페놀 에톡실레이트를 넣고 저어 녹입니다. 4 °C에서 보관하십시오.
      참고: 이 용액은 미리 대량으로 준비하여 -20°C에서 15mL 분취액에 보관하고 염색 프로토콜이 시작되는 날 사용하기 전에 해동할 수 있습니다. 각 염색 프로토콜에 대해 갓 준비하거나 갓 해동한 부분 표본을 사용합니다.
   3. 세척 용액: PBS 995.5mL에 옥틸 페놀 에톡실레이트 4.5mL를 첨가하여 0.45% 옥틸 페놀 에톡실레이트가 보충된 PBS 1L를 준비합니다. 저어 녹이십시오. RT에 보관하십시오.
2. 스테인리스 스틸 사각 모서리 주걱을 사용하여 플레이트에서 물방울을 조심스럽게 들어 올립니다. 중앙을 들어 올리기 전에 먼저 가장자리에서 방울을 분리하고 1mL의 PBS가 들어 있는 12웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
   참고: 이 플레이트 형식으로 사후 고정, 세척 및 차단 단계를 수행합니다.
3. 얼음처럼 차가운 50:50 아세톤:메탄올 용액 1mL로 물방울을 ~1분 동안 수정하십시오(물방울의 경계가 흰색으로 바뀝니다).
   참고: 아세톤과 메탄올은 건강에 해롭으므로 흄 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
4. PBS 2mL에 3-5회 세척하여 헹굽니다(재수화가 완료되면 PBS 용액에 물방울이 가라앉습니다).
   참고: 피펫 팁으로 물방울을 만지지 마십시오. 고정 후 플라스틱에 끈적거리므로 피펫 팁으로 물방울을 만지지 마십시오. 프로토콜 전반에 걸쳐 흡입 후 수정, 항체, 차단 및 흡입에 의한 세척 용액은 액적을 손상시키거나 완전히 파괴할 수 있으므로 피하십시오. 대신, 플레이트를 기울이고 500-5,000 μL 피펫을 사용하여 용액을 조심스럽게 제거합니다.
5. 이물질을 제거하기 위해 21,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 차단 용액을 원심분리합니다.
   참고: 이 용액은 원심분리를 위해 1.5mL 튜브에 분주할 수 있습니다. 사용하지 않은 용액은 4°C에서 보관하고 모든 관련 후속 단계에 사용할 수 있습니다.
6. RT에서 2시간 동안 500μL 차단 용액에 액적을 배양합니다.
   참고: 사용되는 차단 용액의 부피를 줄이기 위해 플레이트를 지지대에서 기울일 수 있으며 최소 300μL의 용액/액적을 사용할 수 있습니다.
7. 1차 항체 혼합물(최소 30μL/방울)을 차단 용액에 적절한 희석으로 준비하고 21,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
8. 모서리가 둥근 주걱을 사용하여 액적을 원형(U)바닥 96웰 플레이트로 옮기고 4°C에서 밤새 1차 항체 혼합물의 최소 30μL/방울로 배양합니다.
9. 다음 날, 물방울을 2mL의 세척액/웰이 들어 있는 12웰 플레이트에 옮기고 먼저 5분 세척 3회로 3회 헹구고 30분 세척 9회로 헹굽니다. 마지막 세척(2mL)을 4°C에서 밤새 그대로 두십시오.
10. 다음 날, PBS로 세 번 헹구고 물방울을 둥근 (U) 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.
11. 세척하는 동안 차단 용액 및 원심분리에 적절한 형광단 접합 2차 항체 혼합물(희석 1:500, 최소 30μL/방울)을 21,000 x g 및 4°C에서 15분 동안
준비합니다.
12. 둥근 모서리 주걱을 사용하여 물방울을 둥근 (U) 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 빛으로부터 보호된 RT에서 4시간 동안 최소 30μL의 2차 항체 혼합물로 배양합니다.
    참고: 빛으로부터 보호되는 모든 후속 배양 및 세척 단계를 수행합니다.
13. 둥근 모서리 주걱을 사용하여 2mL의 세척 용액/웰이 들어 있는 12웰 플레이트에 물방울을 옮기고 먼저 5분 세척 3회로 3회 헹구고 30분 세척 4회로 헹굽니다. 마지막 세척(2mL)을 4°C에서 밤새 그대로 두십시오.
14. 다음 날, 30분 동안 5번 세척한 다음 PBS로 3번 젤을 헹굽니다. 마지막 세척(2mL)을 4°C에서 밤새 그대로 두십시오.
15. 다음 날, 둥근 모서리 주걱을 사용하여 액적을 둥근 (U) 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 RT에서 30분 동안 10μg/mL Hoechst 핵 염색(최소 30μL/액적)으로 배양하여 핵을 대조염색합니다.
    참고: 핵 대조염색을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이 보충된 장착 매체를 대안적으로 사용할 수 있습니다. 이 경우 이 단계와 1.16단계를 건너뛰고 1.17단계로 바로 진행합니다.
16. 모서리가 둥근 주걱을 사용하여 2mL의 PBS/well이 들어 있는 12웰 플레이트에 방울을 옮기고 PBS로 세 번 헹굽니다.
17. 다음과 같이 현미경 슬라이드에 물방울을 장착합니다.
    1. 정사각형 모양의 22mm x 22mm 커버 유리의 가장자리에 빠른 경화 장착 매체의 좁은 층을 바르고 ~1분 동안 건조시킵니다. 장착 매체의 과도한 경화를 방지하기 위해 각 방울에 대해 이 단계를 개별적으로 수행하십시오.
       참고: 속경화 장착 매체는 건강에 해롭으므로 흄 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
    2. 2mL의 탈이온수가 들어 있는 12웰 플레이트의 우물에 담그어 물방울을 헹구고 둥근 모서리 주걱을 사용하여 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 작은 흡수성 종이를 사용하여 여분의 물을 제거하십시오.
    3. 방울에 15μL의 비경화 페이드 장착 매체를 분배합니다.
       참고: 또는 Hoechst 핵 염색을 사용하지 않은 경우 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 포함하는 장착 매체를 사용할 수 있습니다.
    4. 속경화 장착 매체가 미세한 슬라이드를 향하도록 하여 커버 유리를 물방울 위에 부드럽게 놓고 가라앉힙니다.
       참고: 속경화 매체는 미세한 슬라이드에 달라붙어 액적을 제자리에 유지합니다.
18. 모든 물방울에 대해 1.17단계를 반복합니다. 각 현미경 슬라이드에 두 개의 액적을 장착합니다.
19. 슬라이드를 RT에서 ~2시간 동안 자연 건조시키고 4°C에서 밤새 보관하십시오. 슬라이드가 수평으로 배치되고 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.
20. 광학 절편 기능과 20x 또는 40x 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경 또는 직립 형광 현미경을 사용하여 염색된 네이티브 또는 엔드 포인트 FT ex vivo 배양을 이미지화합니다. 타일 기능을 사용하여 한 번에 더 넓은 영역의 조직을 캡처할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재질	,	,	,
세포 배양 플레이트, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	전체 마운트 면역 형광에 사용
원형/편평한 주걱, 스테인리스강	VWR	82027-528	전체 마운트 면역형광에 사용
커버슬립 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	장착에 사용
현미경 슬라이드	Fisher	Kindler K102	사용됨 장착용
흡수지	VWR	115-0202	장착에 사용
PBS 정제	메디카고	09-9400-100	1x PBS 작성에 사용
아세톤	시그마-알드리치	고정 후 용액을 제조하는 데 사용됩니다. 유해한: 보호 장갑 및/또는 의복을 착용하십시오. 흄 후드에 사용하십시오.
메탄올	시그마-알드리치	32213	고정 후 용액을 제조하는 데 사용됩니다. 독성: 보호 장갑 및/또는 의복을 착용하십시오. 흄 후드에 사용하십시오.
Triton X-100 (옥틸 페놀 에톡실레이트)	시그마-알드리치	T9284	전체 마운트 면역 형광에 사용됩니다. 유해한: 보호 장갑 및/또는 의복을 착용하십시오.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	핵 대조염색용. 유해한: 보호 장갑 및/또는 의복, 눈 및/또는 안면 보호구를 착용하십시오.
VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄	Vector Laboratories	H-1000	보호 장갑 및/또는 의복을 착용하고 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에 사용하십시오.
VECTASHIELD DAPI를 사용한 페이드 방지 배지	Vector Laboratories	H-1200	핵 카운터스테인링이 있는 마운팅 배지. 보호 장갑 및/또는 의복을 착용하고 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에 사용하십시오.
유키트 속경화 장착 매체	시그마-알드리치	03989-100ml	독성: 보호 장갑 및/또는 의복을 착용하고 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에 사용하십시오.
재조합 human VEGFA	R&D 시스템	293-VE-010	50 ng/ mL 최종 농도
재조합 human VEGFC	R&D 시스템	752-VC-025	200 ng/ mL 최종 농도
재조합 human TGFβ	GF346	1 ng/ mL 최종 농도
재조합 인간 bFGF	밀리포어	01-106	50 ng/ mL 최종 농도
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	1:100 희석에서 사용, 당나귀 안티 마우스 Alexa 488 보조 Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	1:100 희석에서 사용, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	1:100 희석에서 사용, 당나귀 안티 마우스 Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	1:100 희석, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	1:200 희석에서 사용, 염소 안티 토끼 Alexa 594 보조 Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	1:100 희석에 사용, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	1:100 희석에 사용, 염소 안티 토끼 Alexa 594 보조 Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	1:1500 희석에 사용, 염소 안티 토끼 Alexa 594 보조 Ab
Lyve1	R&D 시스템	AF2089	1:100 희석에 사용, 당나귀 안티 염소 Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	1:100 희석에 사용, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	1:200 희석에 사용, 염소 안티 토끼 Alexa 568 보조 Ab
Prox1	R&D 시스템	AF2727	1:40 희석에 사용, 치킨 안티 염소 Alexa 594 보조 Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	1:100 희석에서 사용, 당나귀 안티 마우스 Alexa 488 보조 Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	1:400 희석에 사용, Cy3 conjugated
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	1:500 희석에 사용
Alexa Fluor594 Goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	1:500 희석에 사용
Alexa Fluor568 당나귀 anti-goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	1:500 희석에 사용
Alexa Fluor568 염소 anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	1:500 희석에 사용
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	{{}}1:500 희석에 사용
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
현미경
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