Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

출처: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization(고해상도 현장 혼성화를 사용한 뇌 절편에서 축삭 국소화 mRNA 검출). J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 형광 현장 혼성화 및 항체 염색을 사용하여 고정 마우스 해마 절편의 콜린성 축삭 내에서 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 콜린성 뉴런에서 프로브 태그가 지정된 mRNA와 콜린 아세틸전이효소의 공간적 국소화를 보여줍니다.

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

FISH assay에 이어 열 유도 항원/RNA 마스킹을 사용하여 면역조직화학
1. 시작하기 전에 필요한 모든 자료를 준비하십시오:
  1. 혼성화로를 40°C로 가열하고 증류수가 들어있는 트레이를 오븐에 올려 가습 환경을 조성합니다.
  2. 슬라이드 상자를 가져와서 증류수에 적신 종이 타월을 안에 넣어 가습합니다. 그런 다음 슬라이드 상자를 하이브리드화 오븐에 넣습니다.
  3. 냉장고에서 프로브(음극 및 대상 프로브 모두)를 제거하고 혼성화 오븐에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 RT에서 프로브를 식히십시오.
  4. Equilibrate amplification reagents AMP 1-4 (Fluorescent Multiplex Reagent Kit에 포함).
  5. 항원 회수 용액 준비: 10mM 구연산나트륨(pH 6), 0.05% 트윈 20. 참고: 용액은 RT에 무기한 보관할 수 있으며 향후 염색에 사용할 수 있습니다.
  6. RNase-free 또는 DEPC 처리된 물에 50x 스톡 용액(형광 멀티플렉스 시약 키트)을 희석하는 1x 세척 버퍼를 준비합니다.
    참고: 1x 세척 버퍼는 RT에서 1개월 동안 보관할 수 있으며 향후 염색에 사용할 수 있습니다. 50x 세척 버퍼가 침전될 수 있습니다. 그렇다면 50x 용액을 준비하기 전에 40°C에서 10분 동안 1x 세척 버퍼를 가열하십시오.
2. 100% 에탄올에서 슬라이드를 제거하고 RT에서 5분 동안 자연 건조합니다.
3. 항원 회수 용액 50ml가 들어 있는 코플린 항아리를 준비합니다. 슬라이드를 항원 회수 용액에 담그고 전자레인지에서 10분 동안 끓입니다.
  참고: 또는 100ml의 회수 용액이 들어 있는 100mm 직경의 둥근 유리 접시에 슬라이드를 수평으로 놓습니다.
  1. 1L 비커에 증류수를 채우고 전자레인지에 넣습니다.
    참고: 물은 마스킹 해제를 수행할 때 열을 "버퍼링"합니다.
  2. 전자레인지 내부의 항원 회수 용액에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드를 고출력으로 5분 동안 끓입니다. 샘플이 끓는 것을 멈춘 직후, 추가로 5분 동안 고출력으로 다시 열을 가열합니다.
  3. RT에서 슬라이드를 식히십시오.
    참고: 중요 단계: 끓는 시간과 절차는 마이크로파 특성에 따라 사용자가 결정해야 합니다. 끓는 속도가 빠를수록 용액 증발 가능성이 높아집니다. 이 경우 총 10분의 마스킹 해제 시간을 완료하기 위해 더 짧은 시간 동안 샘플을 두 번 이상 끓이는 것이 좋습니다. 반대로 중전력 또는 저전력으로 가열을 수행하는 경우 10분 동안 한 번 마스킹 해제를 수행할 수 있습니다. 그러나 샘플이 총 약 10분 동안 계속 끓지 않으면 검출할 표적 RNA와 단백질이 모두 부분적으로 마스킹되지 않을 수 있습니다.
4. 1x PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
5. 배경 염색을 평가하는 데 사용되는 뇌 절편에 dapB 프로브 세트 2 - 3방울(~100μl)을 추가합니다. 참고: dapB 프로브 세트는 박테리아 유전자를 표적으로 하며 포유류 RNA를 인식해서는 안 됩니다.
6. 프로브 증발을 피하기 위해 파라필름으로 슬라이드를 덮고, 혼성화 오븐 내부의 가습 슬라이드 상자에 넣고 40°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  참고: 선택 사항: 추가 뇌 절편은 마우스 Polr2A를 대상으로 하는 프로브 세트와 하이브리드화되어 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
7. RT에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
8. 각 뇌 절편에 증폭 시약 AMP 1-FL 2-3방울을 떨어뜨리고, 파라필름으로 슬라이드를 덮고, 슬라이드 상자에 넣고, 혼성화 오븐에서 40°C에서 30분 동안 배양합니다.
9. RT에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
10. 각 뇌 절편에 증폭 시약 AMP 2-FL 2-3방울을 떨어뜨리고, 파라필름으로 슬라이드를 덮고, 슬라이드 상자에 넣고 40°C에서 15분 동안 혼성화 오븐에서 배양합니다.
11. RT에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
12. 각 뇌 절편에 증폭 시약 AMP 3-FL 2-3방울을 떨어뜨리고, 파라필름으로 슬라이드를 덮고, 슬라이드 상자에 넣고 40°C에서 30분 동안 혼성화 오븐에서 배양합니다.
13. RT에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
14. 각 뇌 절편에 증폭 시약 AMP 4-FL 2-3방울을 떨어뜨리고, 파라필름으로 슬라이드를 덮고, 슬라이드 상자에 넣고 혼성화 오븐에서 15분 동안 40°C에서 배양합니다.
15. RT에서 2분 동안 1x 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
16. PBS(pH 7.4)에서 3mg/ml BSA, 100mM 글리신 및 0.25% Triton X-100을 포함하는 차단 용액 100 - 200μl(또는 슬라이스를 완전히 덮을 수 있는 충분한 부피)를 슬라이드에 추가하고 파라필름으로 덮고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
17. 블로킹 용액(1/100)에 희석된 100 - 200 μl의 항-ChAT 항체를 슬라이드에 추가하고 파라필름으로 덮고 4 °C에서 2일 동안 배양합니다. 뇌 조각이 마르지 않도록 한다. 필요한 경우, 배양 24시간 후 항-ChAT 항체 용액을 뇌 절편에 다시 도포합니다.
18. RT에서 5분 동안 1x PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
19. 100 - 200 μl의 적절한 Alexa-conjugated secondary antibody (예: 이 특정 예제의 경우 Alexa-594 당나귀 anti-goat)를 슬라이드에 추가하고 파라필름으로 덮고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
20. RT에서 5분 동안 1x PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
21. 증류수로 슬라이드를 한 번 씻습니다.
22. DAPI 함유 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다.
23. 형광 현미경으로 뇌 절편을 시각화합니다.

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Custom probe (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	probe
human ATF4 mRNA (NM_001675.2)의 잔류물 15-1256을 표적으로 하는 맞춤형 프로브	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	probe
양성 대조군 프로브-마우스 Polr2A(선택 사항)	고급 세포 진단	312471	프로브
염소 다클론 항-ChAT 항체	Millipore	AB144P	<
Life Technologies	P36935
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)<	320850	In situ hybridization kit

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

이 논문에서

초록

프로토콜

재료

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