고해상도: 망막 시냅스(Retinal Synapse)에서 신경전달물질 수용체(Neurotransport Receptors)의 고해상도(High-resolution) 이미징

초록

출처: Zhang, J., et al. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses(망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고분해능 정량적 면역금 분석). J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 망막 시냅스에서 신경전달물질 수용체 국소화를 시각화하기 위한 전자 현미경 기술을 보여줍니다. 망막 절편에는 막으로 결합된 신경전달물질 수용체를 나타내는 망막 신경절 세포가 포함되어 있으며 콜레라 독소 소단위 B(CTB)로 표지되어 있습니다. 마커를 금 나노 입자 접합 항체로 라벨링하고 중금속으로 단면을 대조염색하면 망막 신경절 세포 수용체가 현미경으로 시각화됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 망막 조직 고정

1. 다음 재료와 도구를 조립하십시오: 해부 현미경, 매우 미세한 팁이 있는 집게 2개, 가위, 셀룰로오스 여과지, 플라스틱 피펫 및 현미경 슬라이드.
2. 밀폐 된 챔버에서 2.0ml의 할로탄 (흡입 마취제)으로 쥐를 마취시킵니다. 다음 방법으로 적절한 마취를 결정하십시오: 발가락 꼬집 후 뒷발이 빠지지 않거나 깜박임 반사가 부족합니다. 그런 다음 단두대로 즉시 목을 베십시오. 홍채 가위로 눈을 제거하고 pH 7.4에서 0.1M 인산염 완충액(PB)에 4% 파라포름알데히드가 함유된 유리 접시에 담습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드	EMS	15710
글루타르알데히드	EMS	16019
NaH2PO4	시그마	S9638
Na2HPO4	시그마	7782-85-6
CaCl2	시그마	C-8106
BSA	시그마	A-7030
트리톤 X-100	시그마	T-8787
NaOH	시그마	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
글리세롤	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	희석 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	희석 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	희석 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1-046	희석 1/100
당나귀 안티 토끼 IgG-10 nm 금 입자	EMS	25704	희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-10 nm 금 입자	EMS	25814	희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-5 nm 금 입자	EMS	25812	희석 1/20
당나귀 안티 염소 IgG-18 nm 금 입자	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	희석 1/20
Formvar-Carbon 코팅 니켈 슬롯 그리드.	EMS	FCF2010-Ni
우라 닐 아세테이트	EMS	22400-1
메탄올	EMS	67-56-1
리드 시트레이트	라이카
라이카 EM AFS	라이카
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
액체 질소	Roberts Oxygen
프로판	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000