고해상도: 망막 시냅스(Retinal Synapse)에서 신경전달물질 수용체(Neurotransport Receptors)의 고해상도(High-resolution) 이미징

초록

출처: Zhang, J., et al. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses(망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고분해능 정량적 면역금 분석). J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 망막 시냅스에서 신경전달물질 수용체 국소화를 시각화하기 위한 전자 현미경 기술을 보여줍니다. 망막 절편에는 막으로 결합된 신경전달물질 수용체를 나타내는 망막 신경절 세포가 포함되어 있으며 콜레라 독소 소단위 B(CTB)로 표지되어 있습니다. 마커를 금 나노 입자 접합 항체로 라벨링하고 중금속으로 단면을 대조염색하면 망막 신경절 세포 수용체가 현미경으로 시각화됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 망막 조직 고정

1. 다음 재료와 도구를 조립하십시오: 해부 현미경, 매우 미세한 팁이 있는 집게 2개, 가위, 셀룰로오스 여과지, 플라스틱 피펫 및 현미경 슬라이드.
2. 밀폐 된 챔버에서 2.0ml의 할로탄 (흡입 마취제)으로 쥐를 마취시킵니다. 다음 방법으로 적절한 마취를 결정하십시오: 발가락 꼬집 후 뒷발이 빠지지 않거나 깜박임 반사가 부족합니다. 그런 다음 단두대로 즉시 목을 베십시오. 홍채 가위로 눈을 제거하고 pH 7.4에서 0.1M 인산염 완충액(PB)에 4% 파라포름알데히드가 함유된 유리 접시에 담습니다.
3. 해부 현미경을 사용하여 안구 앞쪽을 잘라 각막을 제거합니다. 집게로 내부 망막 표면에서 수정체와 유리체를 제거합니다.
4. 망막이 아이컵에서 분리될 때까지 두 개의 집게로 공막을 벗깁니다.
5. 면도기로 망막을 즉시 100 - 200 μm 두께의 스트립으로 자르고 pH 편이 고정합니다.
6. pH 6.0에서 20-30분 동안 0.1M PB의 4% 파라포름알데히드로 망막 스트립을 고정한 다음 실온(RT)에서 10-20분 동안 pH 10.5에서 4% 파라포름알데히드와 0.01% 글루타르알데히드로 망막 스트립을 고정합니다.
7. 0.15mM CaCl₂(4°C에서 pH 7.4)로 PB를 여러 번 세척한 후 동결 치환 전에 0.1M PB에서 글리세롤(10%, 20%, 30%에서 각각 60분[O/N])로 망막 스트립을 동결 보호합니다.

2. 동결 대체

참고: 이 동결 대체 방법은 이전에 발표된 프로토콜에서 수정되었습니다. 또한 악기가 매우 차가워야 합니다(장갑 착용). 그렇지 않으면 기구로 만졌을 때 조직이 부분적으로 해동될 수 있습니다. 이러한 모든 단계는 자동 동결 대체(AFS) 챔버 내에서 수행되며 기기가 챔버 가장자리 위로 이동할 수 없습니다. 마찬가지로 AFS에 사용되는 모든 화학 물질의 적절한 냉각이 필요합니다.

1. 전자 현미경(EM) 동결 보존 기기(CPC)에서 -184°C의 액체 프로판에 망막 스트립을 플런지 동결합니다. 가는 브러시를 사용하여 플런징 로드 끝에 있는 금속 스터브에 부착된 작은 양면 테이프 조각에 샘플을 놓습니다(브러시를 사용하여 추가 버퍼를 심어냅니다).
2. 막대를 액체 프로판에 넣고 약 5초 동안 그대로 둔 다음 액체 질소(LN₂ 냉각 냉동 전사 용기)로 채워진 작은 운송 챔버를 사용하여 자동 동결 대체 기기(AFS)로 옮깁니다.
3. 위치 얼어붙은 샘플과 기구(겸자 및 메스)를 AFS에 넣은 후, 조직을 만지기 전에 챔버 내의 기구를 몇 분 동안 냉각시키거나, 기구의 끝을 작은 운송 챔버(액체 질소(LN₂ 냉각된 극저온 이송 용기로 채워짐))에 몇 초 동안 넣어 냉각시킵니다.
4. AFS에 들어가면, s를 제거하십시오amp고운 메스를 사용하여 스텁에서 테이프와 테이프를 붙입니다. 또한 이러한 절차를 수행하는 동안 질소 가스 흐름 제어 장치인 TF(TF는 'LN₂ 기화기에 대한 조절기 제어'로 설명됨)를 열어 두십시오.
5. 얼어붙은 조직을 플랫 임베딩 홀더에 넣기 전에(즉, 즉, , AFS를 설정하기 전에) 투명한 플라스틱 시트에서 얇은 원을 잘라 홀더 바닥에 놓아 각 웰의 바닥에 줄을 긋습니다. 이를 통해 완료 시 중합된 시편 블록을 비교적 쉽게 제거할 수 있습니다.
   참고: 이전에는 플랫 임베딩 홀더에 대한 대체 방법을 사용하고 이중 Reichert+젤라틴 캡슐을 사용했습니다.
6. AFS에서 다음 자동 순서를 사용하십시오(기기 용어 사용): T1 = -90°C 32시간 동안, S1 = 4°C/hr (11.3시간) 온도 증가, T2 = -45°C 50시간 동안, S2 = 5°C/hr (9시간) 온도 증가, T3 = 40시간 동안 0°C (총 = 142.3시간). 시간 지정 시퀀스를 시작하기 전에 AFS(-90°C)에 샘플을 배치하는 데 2 - 4시간이 걸릴 수 있습니다.
7. AFS에서 >32시간 동안 -90°C의 메탄올에 1.5% 우라닐 아세테이트에 동결된 섹션을 담그십시오. 평평하게 삽입된 알루미늄 홀더에 있는 7개의 웰 각각에 두 개의 티슈 조각(일반적으로)을 놓습니다(3개는 AFS에 맞음).
   1. 우물의 우라닐 아세테이트/메탄올에 조직+테이프를 넣고 테이프에서 조직을 제거하는 것이 너무 어려운 경우 매립 매체(예: Lowicryl HM20) 침투를 시작하기 직전에 테이프를 제거합니다.
8. 그런 다음 온도를 -45°C(시간당 +4°C)로 단계적으로 높입니다. 자동 순서에 따라 온도를 높입니다.
9. 끝이 가는 플라스틱 피펫을 사용하여 각 플랫 임베딩 홀더에서 기존 용액을 제거한 다음 다른 표준 플라스틱 피펫을 사용하여 사전 냉각된 새 메탄올을 추가하여 예냉각된 메탄올로 샘플을 세 번 세척합니다.
10. 그런 다음 동일한 방법을 사용하여 매립 매체(HM20/메탄올, 1:1 및 2:1, 각각 2시간, 순수 수지)와 같은 저온 매립 수지를 점진적으로 침투시킨 다음 수지를 교환하고 O/N을 유지합니다.
11. 다음날 수지를 다시 교체하여 우물의 상단 가장자리에 도달하도록 수지의 높이를 조정합니다.
12. 샘플을 40시간 동안 자외선(UV)으로 중합합니다(자동 순서로 -45°C에서 0°C, 시간당 +5°C).
13. 그런 다음 AFS에서 샘플을 제거합니다. 일반적으로 샘플 블록은 여전히 약간의 분홍색을 보입니다. 샘플을 화학 흄 후드의 형광등 가까이, RT O/N 이상에서 완전히 투명하게 나타날 때까지 놓습니다.

3. EM Immunogold Immunocytochemistry

1. 삽입 후 초박 절편으로 1μm 절편을 절단하고 1% 톨루이딘-블루로 절편을 염색하고 절편 방향을 검사합니다. 최적의 횡단면을 얻기 위해 조직 블록의 방향을 지정합니다.
2. 초박 절편기로 70nm 두께의 초박형 절편을 절단하여 Formvar-carbon-coated 니켈 슬롯 그리드에 수집합니다.
3. 증류된 H₂O로 그리드를 한 번 세척한 다음 Tris-buffered saline을 세 번 세척(TBS, 0.05 M Tris buffer, 0.7% NaCl, pH 7.6)합니다.
4. TBS에서 5% 소 혈청 알부민(BSA) 20μl 방울에서 그리드를 30분 동안 배양한 다음 염소 항콜레라 독소 소단위 B(항-CTB, 1:3,000) 및 하나의 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 소단위체(항토끼 글루타메이트성 NMDAR 소단위 A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) 또는 항토끼 GluA2/3(이α종-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이옥사졸프로피온산[AMPA] 수용체)을 포함하는 혼합물의 20μl 방울, 1:30) TBS-트리톤(TBST, 0.01% 트리톤 X-100, pH 7.6)에서 2% BSA 및 0.02M NaN₃ O/N RT.
5. TBS(pH 7.6)를 3방울(20μl)로 10분, 10분, 20분 동안 그리드를 세척한 다음 TBS(pH 8.2)를 5분 동안 세척합니다.
6. 2시간 동안 그리드를 배양합니다. 당나귀 항 토끼 면역 글로불린 G (IgG, 1:20)를 포함하는 혼합물의 방울 (20 μl) 10 nm 금 입자 및 당나귀 항 염소 IgG (1:20)에 결합 18 nm 금 입자 TBST (pH 8.2) 2 % BSA 및 0.02 M NaN ₃.
7. TBS(pH 7.6) 20μl 방울로 그리드를 5, 5, 10분 동안 세척한 다음 초순수에서 세척한 다음 건조시킵니다.
8. 어두운 조건에서 각각 8분 및 5분 동안 증류된 H₂O에 5% 우라닐 아세테이트와 0.3% 납 시트레이트를 사용한 카운터스테인 그리드.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드	EMS	15710
글루타르알데히드	EMS	16019
NaH2PO4	시그마	S9638
Na2HPO4	시그마	7782-85-6
CaCl2	시그마	C-8106
BSA	시그마	A-7030
트리톤 X-100	시그마	T-8787
NaOH	시그마	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
글리세롤	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	희석 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	희석 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	희석 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1-046	희석 1/100
당나귀 안티 토끼 IgG-10 nm 금 입자	EMS	25704	희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-10 nm 금 입자	EMS	25814	희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-5 nm 금 입자	EMS	25812	희석 1/20
당나귀 안티 염소 IgG-18 nm 금 입자	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	희석 1/20
Formvar-Carbon 코팅 니켈 슬롯 그리드.	EMS	FCF2010-Ni
우라 닐 아세테이트	EMS	22400-1
메탄올	EMS	67-56-1
리드 시트레이트	라이카
라이카 EM AFS	라이카
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
액체 질소	Roberts Oxygen
프로판	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000