재조합 세포에서 Odorant Receptor 활성화에 대한 실시간 모니터링

초록

출처: de March, C. A. et. al., 증기 단계에서 냄새 물질에 의한 냄새 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 발광 측정을 사용하여 재조합 포유류 세포에서 냄새 수용체의 실시간 활성화를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 냄새 물질 결합은 G-단백질 활성화 및 cAMP 생산을 유발하여 기질 결합 시 발광을 방출하는 글로센서 단백질을 활성화하여 수용체 반응의 정량적 측정을 제공합니다.

프로토콜

1. Hana3A Cells Culture

1. M10(최소 필수 매체(MEM) 플러스 10% v/v 소 태아 혈청(FBS)) 및 M10PSF(M10 플러스 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 1.25μg/mL 암포테리신 B)를 준비합니다.
2. 37°C와 5% 이산화탄소(CO2)로 설정된 인큐베이터에서 100mm 세포 배양 접시에 10mL의 M10PSF로 세포를 배양합니다.
3. 2일마다 세포를 20% 비율로 나눕니다: 위상차 현미경에서 세포의 100% 합류(약 1.1 x 10⁷ 세포)가 관찰되면 배지를 흡인하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척합니다.
4. PBS를 흡인하고 0.05% 트립신-에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA, 0.48mM) 3mL를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 약 1분 동안 그대로 두십시오.
5. M10 5mL를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 플레이트에 여전히 부착된 세포를 분리합니다.
6. 부피(8mL)를 15mL 튜브에 넣고 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 흡인하고 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 파괴하여 세포를 5mL의 M10PSF로 재현탁합니다. 튜브에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
7. 새로운 100mm 세포 배양 접시에 재현탁 세포 용액 1mL를 옮기고 신선한 M10PSF 9mL를 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 배양하십시오.

2. Transfection을 위한 세포의 준비

1. 위상차 현미경으로 관찰하여 세포의 합류점 또는 세포의 수를 평가합니다. 하나의 플레이트에 최소 10%의 합류점(약 1.1 x 10⁶셀)이 필요합니다.
2. 배지를 흡인하고 PBS 10mL로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS를 흡입하고 EDTA 3mL를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 실온에서 약 1분 동안 그대로 두십시오.
3. M10 5mL를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 플레이트에 여전히 부착된 세포를 분리합니다. 부피(8mL)를 15mL 튜브에 옮기고 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 흡인하고 세포 덩어리를 부수기 위해 위아래로 피펫팅하여 세포를 5mL의 M10PSF로 재현탁시킵니다. 튜브에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
5. transfection할 plates의 수에 따라, 적절한 양의 M10PSF를 가진 저장소에 적절한 양의 세포를 이송합니다. 96웰 플레이트 1개는 총 부피 6mL에 도달하기 위해 M10PSF로 희석된 100% 합류 100mm 접시(약 1.1 x 10⁶개 셀)의 1/10으로 도금해야 합니다. 100% confluence 100mm 접시로 시작하는 96웰 플레이트 1개의 경우, 5mL의 재현유 세포에서 500μL를 5.5mL의 새로운 M10PSF에 추가합니다. 기포를 생성하지 않고 셀과 M10PSF를 혼합합니다.
6. 다채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 50μL의 부유 세포를 피펫팅합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 밤새 배양하십시오.

3. Plasmid Transfection

1. 30%와 50% 사이의 세포 합류를 보장하기 위해 위상차 현미경으로 96웰 플레이트를 관찰합니다.
2. 표 1의 부피를 따라 전체 플레이트에 공통적인 플라스미드(수용체 수송 단백질 1(RTP1S), 냄새 수용체(OR) 및 글로센서 단백질의 짧은 버전, 재료 표 참조)을 포함하는 첫 번째 형질 주입 혼합물을 준비합니다. Rho 태그가 지정된 OR의 수량은 OR이 여러 개인 경우 OR의 수로 나누어야 합니다.
   참고: 실험 계획에 빈 벡터 음성 대조군(여기서는 Rho-pCI)과 양성 대조군(또는 테스트된 냄새 물질에 반응하는 것으로 알려짐)을 추가하는 것이 좋습니다.
3. 500 μL의 MEM과 20 μL의 Lipofectamine 2000 시약을 포함하는 두 번째 transfection mix를 준비합니다(하나의 96-well 플레이트에 유효, 재료 표 참조). 두 번째 믹스를 첫 번째 믹스에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. M10 5mL를 넣고 부드럽게 섞습니다.
4. 이전에 평평한 96웰 플레이트의 M10PSF를 최종 transfection media의 50μL로 교체합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂로 설정된 인큐베이터에서 배양하고 밤새 광도계의 챔버를 진공 청소기로 청소합니다.

4. substrate incubation

1. 60%와 100% 사이의 세포 합류를 보장하기 위해 위상차 현미경으로 96웰 플레이트를 관찰합니다. 10mM의 하이드록시에틸 피페라진에탄술폰산(HEPES)과 5mM의 D-글루코스를 함유한 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)의 시뮬레이션 용액을 준비합니다.
2. cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 시약(재료 표 참조) 용액 75μL를 자극 용액 2.75mL에 희석합니다. 96-well 플레이트에서 transfection medium을 제거하고 각 well에 50μL의 새로운 자극 용액을 추가하여 세포를 세척합니다.
3. 자극 용액을 제거하고 4.2단계에서 준비한 cAMP 시약 용액 25μL를 각 웰에 추가합니다. 96웰 플레이트를 어둡고 냄새가 없는 환경(예: 화학 물질 또는 냄새 유발원이 없는 깨끗하고 빈 서랍)의 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

5. 냄새 자극

1. 먼저, 발광계 챔버를 휘발성 냄새 분자로 평형을 이룹니다. 광유 10mL에 냄새 물질을 원하는 농도로 희석합니다(그림 1A). cAMP 시약 배양 시간이 끝나기 전에 25μL의 냄새 용액을 새로운 96웰 플레이트(세포가 포함된 플레이트가 아님)에 추가합니다. 이 냄새 플레이트를 발광계 챔버의 실온에서 5분 동안 배양합니다(그림 1B)(여기에는 광도계 기록이 필요하지 않음).
2. 주기 간 0.7초 간격으로 90초의 플레이트 측정 20주기 동안 0초의 지연으로 발광을 기록하도록 광도계를 설정합니다.
3. 플레이트를 읽기 직전에 챔버에서 냄새 플레이트를 제거합니다. 세포가 포함된 96웰 플레이트의 웰 사이에 25μL의 냄새 물질을 추가하고(세포가 포함된 웰에 냄새 물질을 추가하지 마십시오) 30분 이내에 20주기 동안 모든 웰의 발광 측정을 빠르게 시작합니다(그림 1C).

표 1: transfection을 위한 혼합. MEM에 추가할 플라스미드(Glosensor 단백질, RTP1S 및 OR)의 양은 하나의 96웰 플레이트에 transfection합니다.

	96웰 플레이트당
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

결과

그림 1: 기화된 취재에 의한 취기 수용체 활성화를 실시간으로 모니터링하기 위한 개략적인 프로토콜. 부취제(보라색)를 광유(A)에 원하는 농도로 희석했습니다. 그런 다음 용액을 새로운 96웰 플레이트에 도금하고, 이를 5분 동안 광도계 챔버에 넣어 형질주입된 96웰 플레이트(B)를 모니터링하기 전에 기화된 냄새 물질로 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% 트립신 - EDTA (1x), 페놀 레드 - 4 °C
100 mm 세포 배양 dish	BD 팔콘	353003	100 mm x 20 mm 세포 배양 접시
15 mL tube	BD 팔콘	352099	17 mm x 120 mm 원뿔형 튜브
96-well plate	코닝	3843	96 글쎄, LE 뚜껑이 흰색이고 바닥이 투명한 Poly-D-lysine 코팅 폴리스티렌
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 μg/mL - 4 °C
Centrifuge machine	Jouan	C312	15
NUAIRE
NU-407-500	fumehood
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP 시약 발광 단백질 기질 - -20 °C에서 보관
인큐베이터 37 °C; 5 % 이산화탄소	Fisher Scientific	11-676-604<
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019<
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 발광
Mineral oil	Sigma	M8410	취제용 용제 - 실온에서 보관
최소 필수 매체 (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Earle's salts & L-glutamine이 함유된 최소 필수 미디엄 이글 - 4 °C
페니실린/스트렙토마이신	Sigma Aldrich	P4333	페니실린 10,000 U와 스트렙토마이신 10 mg으로 안정화된 페니실린-스트렙토마이신 용액 - -20 °C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP 발광 단백질 플라스미드 - 4 °C
위상차 microscope	Leica	090-131.001	x4, x10, x20 대물렌즈가 있는 위상차 현미경
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL 플라스미드 -

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