Inducing Blood Clot Formation in the Mouse Brain Using a Photosensitive Dye

초록

출처: Talley Watts, L., et al. 컨포칼 광학 이미징 In Vivo에 의한 로즈 벵골 광혈전증: 단일 혈관 뇌졸중 모델. J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 혈전 형성을 유도하는 기술을 보여줍니다. 두개골 창과 얇아진 두개골을 가진 마취된 쥐는 고강도 빛을 사용하여 감광성 염료의 활성화를 통해 광혈전증을 겪습니다. 이 과정은 혈관 벽을 손상시키고 혈전 형성을 유발하여 궁극적으로 뇌로 가는 혈류를 방해하는 활성 산소 종을 생성합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 피질 준비를 위한 마취

1. 마취를 유도하기 위해 산소와 혼합된 2-3% 이소플루오란이 있는 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스가 유도됨에 따라 호흡수가 감소하는 것을 관찰하십시오. 마우스의 발을 꼬집어 마우스가 콧방울로 이동할 준비가 되었는지 확인합니다. 참고: 마취 수준은 모든 생체 내 준비에서 중요한 단계이며 전반적인 허혈을 유발할 수준을 유도하지 않도록 주의
해야 합니다.
2. 마우스가 충분히 마취되면 동물을 수술/이미징 플랫폼으로 옮기고 마우스의 코를 콧방울에 놓고 1-1.2% 이소플루오란을 적용하여 마취 상태를 유지합니다. 나머지 절차 동안 체온(37°C +/- 0.5°C)을 유지하기 위해 마우스가 온도 조절 가열 패드 위에 누워 있는지 확인하십시오. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈 위에 바르십시오.
3. 시스템과 함께 제공된 꼬리 또는 발 클립을 사용하여 맥박 산소 측정 시스템을 사용하여 마우스의 생리학을 모니터링합니다. 호흡수가 50-65 호흡/분 사이로 유지되는지 확인하십시오. 동물의 장기 생존을 보장하기 위해 심박수가 300-450bpm 사이로 유지되고 산소 포화도가 97-98% 사이로 유지되는지 확인하십시오.
4. 마우스가 적절하게 마취되면 전기 가위를 사용하여 두개골 위의 머리카락을 면도하고 잔여 머리카락을 제거한 다음 베타딘으로 청소한 다음 에탄올 면봉으로 청소합니다. 멸균된 수술 환경을 보장하기 위해 이 절차를 최대 3회 반복합니다.

2. Surgical Procedure

1. 두피를 완전히 청소하고 면도한 상태에서 마우스의 두피를 5mm 절개하여 두개골 균열을 드러내고 브레그마를 찾습니다.
2. Bregma의 입체 좌표(-1-3mm, 측면: 2-4mm)를 사용하여 두정엽 피질 위에 있는 뼈에 조직 접착제가 있는 맞춤형 스테인리스 스틸 링(그림 1)을 붙입니다. 참고: 접착제는 일반적으로 뼈에 링을 배치한 후 2분 이내에 굳습니다.
3. 링을 입체 홀더(그림 2)에 부착하여 마우스를 안정화하고 이미징 중 움직임을 방지합니다.
4. 수술용 해부 현미경 아래에서 속도 조절이 가능한 드레멜과 같은 도구(Meisinger 3.9mm 드릴 비트)를 사용하여 두개골에서 1-2mm 부분을 천천히 드릴링하여 드릴링할 때 영역 수평을 유지하십시오. 지그재그 패턴을 사용하여 이를 달성하십시오. 열 축적을 방지하려면 드릴 속도를 낮게 설정하고 자주 휴식을 취하십시오.
5. 두개골이 광택이 나면 두개골의 얇은 층을 부드럽게 제거할 수 있도록 얇은 표면을 수평으로 유지하기 위해 동일한 지그재그 패턴을 사용하는 메스 날을 사용하여 두개골을 얇게 계속 만듭니다. 메스 칼날 끝을 사용하여 가벼운 압력으로 작은 선형 스트로크를 만들어 한 번에 얇은 뼈 층을 제거합니다. 해부 현미경을 통해 혈관 구조가 명확하게 보일 때까지 계속합니다.
6. 엷게 하는 과정에서 실험자가 두개골에 구멍을 뚫거나 두개골을 부러뜨리면 밑에 있는 피질이 손상될 가능성이 있으므로 동물을 안락사시킵니다.
   참고: 쥐의 두개골은 두께가 약 300μm이며 두 개의 얇은 조밀한 뼈 층(외부 층 하나와 내부 층 하나)과 두 개의 조밀한 뼈 층 사이에 끼워진 해면질 뼈 층으로 구성되어 있습니다. 조밀한 뼈의 외부 층과 대부분의 해면질 뼈는 5mm 시추 영역 내에서 제거되어 약 50μm의 조밀한 뼈 층이 남게 됩니다(그림 2B 참조). 혈관 구조를 시각화하면 최종적으로 얇아진 두개골의 두께가 약 50μm가 됩니다. 따라서 두개골은 이 두께로 얇아졌을 때 여전히 존재합니다.

3. Microscope Set-up

1. 대물 인버터가 있는 도립 현미경 시스템(기존, 공초점 또는 이광자 시스템)을 사용하십시오. 참고: 표준 정립 현미경을 사용하는 것도 가능합니다. 제한 요소는 스테이지와 목표 사이의 공간입니다. 이 설정을 수행하려면 스테이지를 수정해야 할 수 있습니다.
2. 현미경 바닥 옆에 위치한 맞춤형 스테이지에 수술/이미징 플랫폼을 고정합니다. 참고: 플랫폼은 대물렌즈 아래에서 수술/이미징 플랫폼의 수직 이동을 허용하기 위해 실험실 잭을 사용하여 만들어집니다. 실험실용 잭은 4개의 원통형 기둥에 부착된 플레이트에 장착됩니다. (그림 2 참조).
3. 20X 대물렌즈가 포함된 대물렌즈 인버터를 두개골 창 위에 배치합니다. 외부 광원을 사용하여 현미경의 접안렌즈를 통해 두개골 창을 찾고 이미징 영역에 대물렌즈를 배치합니다.참고 : 이미징 영역은 혈관 구조의 존재로 표시됩니다.
4. 수성 대물렌즈의 경우, 이미징 중 두개강으로의 잠재적 누출로 인해 인공 뇌척수액(aCSF)(130mM NaCl; 30mM KCl; 12mM KH₂PO₄; 200mM NaHCO₃; 30mM hydroxyethylpiperazine ethane sulfonic acid [HEPES]; 및 100mM glucose)을 배지로 사용합니다(그림 3).

4. 로즈 벵골 염료 준비, 투여 및 스트로크의 유도

1. CSF에서 로즈 벵골의 신선한 20mg/ml 용액을 준비하십시오. 투여 전에 여과하고 살균하십시오. 로즈 벵골을 한 번 혼합하면 재사용하거나 보관하지 마십시오. 각 실험에 대해 새로운 솔루션을 만듭니다.
2. 561nm 레이저로 두개골 창을 스캔하면서 Rose Bengal의 0.1ml 꼬리 정맥 주사를 제공하여 용액의 적절한 주입을 보장합니다. 참고: 로즈 벵갈은 뇌의 혈관 구조에 주입된 후 5초 이내에 시각화됩니다. 전체 용기는 로즈 벵갈로 채워져야 합니다.
3. 로즈 벵골 염료를 적절하게 주입한 후 특정 병변 부피의 재현성을 보장하기 위해 혈관 직경(40-80μm)을 기준으로 혈전증에 적합한 혈관을 선택합니다. 혈류의 방향을 보고 동맥과 정맥을 구별하십시오: 동맥은 큰 직경의 혈관에서 작은 직경의 혈관으로 이동하고, 정맥은 작은 직경의 혈관에서 큰 직경의 혈관으로 이동합니다. 이것은 Rose Bengal이 주입되면 시각화를 통해 쉽게 달성할 수 있습니다.
4. 현미경 설정을 다음과 같이 변경합니다.
   1. 체류 시간을 늘립니다. 참고: 이는 사용 중인 현미경 시스템에 따라 다릅니다.
   2. 레이저 출력을 100%로 높입니다.
   3. 최대 스캔 속도를 사용하여 초당 1프레임으로 시간 순서 이미지를 수집합니다.
5. 혈관 내에 안정적인 응고가 형성될 때까지 마우스를 스캔합니다. 참고: 이는 일반적으로 연속 스캔 후 5분 이내에 달성됩니다(그림 4 참조).
6. Rose Bengal을 사용하여 혈전 형성을 유도한 후 이미징 영역에서 마우스를 제거하여 해부 현미경으로 다시 이동합니다. 두개골에서 스테인리스 스틸 링을 조심스럽게 제거합니다. 두개골 창에 출혈이 있는지 검사합니다. 출혈이 발생하면 실험을 종료하십시오.
7. 6.0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 두개골 위의 절개 부위를 봉합합니다. 감염을 예방하기 위해 봉합선을 따라 항생제 연고를 바르십시오. 통증 관리를 위해 3일 동안 12시간마다 부프레넥스(0.05mg/kg)를 피하 주사합니다.
8. 완전히 깨어나 자유롭게 움직일 때까지 마취제를 제거한 후 마우스를 회수실로 되돌립니다.
9. 나중에 추가 조사를 위해 마우스를 깨끗한 케이지로 되돌립니다.

결과

그림 1: 스테인리스 스틸 링. 스테인리스 스틸 링 홀더에 대한 세 가지 보기(위, 측면 및 아래)가 표시되어 있으며, 이 홀더는 마우스의 두개골에 적용되어 입체 홀더에 부착됩니다.

그림 2: RB 광혈전증을 위한 현미경 이미징 플랫폼 설정....

재료