이 비디오는 바이러스 현탁액을 배측근신경절(DRG)에 주입하고 마취된 쥐에서 등쪽 뿌리 분쇄를 통해 제어된 축삭 손상을 유도하는 단계별 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 DRG를 노출시키고, 축삭 재생을 촉진하기 위해 성장 촉진 바이러스 벡터를 전달하고, 감각 신경 손상 및 재생을 모델링하기 위해 척수에 대한 축삭 연결을 절단하는 것이 포함됩니다.
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방법 논문
배근 신경절 주입 및 등뿌리 크러시 손상을 사용하여 쥐의 감각 축삭 재생 모델링
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2025년 4월 28일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. DRG 주입 및 등뿌리 크러시 손상 시행
참고: 이것은 매우 섬세한 수술입니다. 살아있는 동물 수술로 진행하기 전에 해부학에 익숙해지기 위해 먼저 몇 마리의 죽은 동물에 대해 연습하는 것이 좋습니다.
- 피부 위에서 두드러진 C2 및 T2 가시돌기를 찾습니다. 10번 메스 날로 C2와 T2 가시돌기 사이를 절개한다(일단 피부가 열리면 근육의 첫 번째 층에서 흰색 섬유 조직 정중선이 보여야 하며, 근육의 첫 번째 층은 "젤리 같은" 질감을 가지고 있어야 한다).
- 메스 날을 사용하여 흰색 정중선을 따라 근육의 첫 번째 층을 비슷한 크기로 절개합니다. 눈에 띄는 T2 가시돌기를 넘어서지 마십시오, 그 근처에 하행 대동맥에서 주요 동맥 가지가 있기 때문입니다.
참고: 이 단계부터 과다 출혈이 발생할 수 있습니다. 항상 멸균된 면봉이나 수술용 흡수성 스폰지를 사용하여 출혈을 멈추고 혈액을 제거하여 항상 명확하게 시각화할 수 있습니다. "맹목적으로" 절차를 진행하면 척수, DRG 또는 등뿌리에 원치 않는 손상이 발생하여 나중에 동물에게 예상치 못한 부작용을 초래할 수 있습니다. - 두 개의 견인기를 사용하여 근육의 첫 번째 층을 수축시키는데, 하나는 주상으로, 다른 하나는 꼬리 방향으로 배치됩니다. 줄무늬 모양의 근육의 두 번째 층이 보여야 합니다.
- 두 번째 근육 층의 정중선을 찾습니다(얇은 막질 조직으로 연결된 두 개의 세로 근육을 관찰할 수 있는 곳). 두 개의 세로 근육을 분리하기 위해 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 막 조직을 절개합니다. 메스 날은 불필요한 근육 손상과 출혈을 유발할 수 있으므로 가능하면 사용하지 마십시오.
- 척추를 덮고 있는 얇은 근육의 세 번째 층이 노출되도록 그에 따라 견인기를 조정합니다. 가시돌기는 근육의 세 번째 층 위에 한 쌍의 집게로 가볍게 만지면 느낄 수 있습니다.
- 마이크로가위를 이용하여 3층의 근육을 작게 절개한 후 큐렛이나 메스를 사용하여 뼈에서 근육을 옆으로 부드럽게 긁어내면 척추뼈가 선명하게 드러납니다. 필요한 경우 후판 절제술을 더 쉽게 하기 위해 근육이나 힘줄의 일부를 잘라냅니다.
- 왼쪽 C5 - C8 DRG를 노출시키려면 한 쌍의 미세한 롱거를 사용하여 얇은 판과 척추경의 일부를 조심스럽게 제거하여 C4 - T1 척추에 좌반층 절제술을 수행합니다. DRG는 척추뼈의 횡방향 구멍 근처에 있습니다.
참고: C3 - C7 척추뼈는 눈에 띄는 가시돌기가 없습니다. C5 DRG는 C4와 C5 척추 사이에 위치하고, C6 DRG는 C5와 C6 척추 사이에 위치하며, C8 DRG는 C7과 T1 척추 사이에 있습니다. C8 DRG와 C8 척수 분절이 있음에도 불구하고 C8 척추는 없습니다. - DRG가 주사용으로 충분히 노출되면 맞춤형 33게이지 뭉툭한 바늘이 장착된 바이러스로 채워진 마이크로리터 주사기를 정위 주사기 홀더에 올려 주사기를 준비합니다. 주사 전에 30게이지 경사진 바늘을 사용하여 주사 바늘 삽입을 돕기 위해 각 대상 DRG에 작은 표면 구멍을 만듭니다.
- 손잡이를 부드럽게 돌려 입체 좌표를 조정하여 33게이지 바늘을 DRG 중앙에 삽입합니다. DRG의 복부 쪽에서 액체가 누출될 수 있으므로 바늘을 과도하게 삽입하지 마십시오. 누출이 발생하면 즉시 바늘의 위치를 조정하십시오.
참고: 숫자 입체 좌표는 사용되지 않습니다. 그러나 주사를 위해 바늘을 잡기 위해 프레임을 사용하는 것이 도움이 됩니다. 위치 - 주입 주사기 펌프를 사용하여 0.2μL/분의 속도로 각 DRG에 1μL의 바이러스를 주입합니다. 바늘을 빼기 전에 3분 더 기다리십시오. 주입하는 동안 바이러스 용액에 유색 염료가 포함되어 있으면 DRG의 색이 천천히 변합니다.
- 동시 C5 - C8 등쪽 뿌리 충돌 부상을 수행하려면 한 쌍의 가는 끝이 있는 집게(Bonn Micro)를 사용하여 집게의 끝을 완전히 반대쪽으로 하여 각 뿌리를 각각 10초 동안 세 번 부수십시오. 조직의 흰색 선이 으깬 부위에 나타나야 합니다. 복부근에 손상을 줄 수 있으므로 겸자로 필요한 것보다 더 깊이 들어가지 마십시오.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | 무색 솔루션을 시각화하기 위해. 권장 농도 : 1 % |
| Olsen-Hegar 바늘 홀더 | |||
| 프리드먼 피어슨 롱거 커브드 0.7mm 컵 | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | 등쪽 뿌리 충돌 부상 |
| 조직 분리 가위 | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas 스프링 가위(스트레이트) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM 흡수성 젤라틴 스폰지 | Ethicon | 1972 | 출혈 제어 |
| 마이크로리터 주사기 RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| 맞춤형 이동식 바늘(DRG 주입용) | Hamilton | 7803-05 | 33 게이지, 38mm, 포인트 스타일 3 |
| SYS-Micro4 컨트롤러가있는 UltraMicroPump |
