레이저로 유도된 뇌 손상 쥐 모델에서 혈액-뇌 장벽 무결성 평가

초록

출처: Kuts, R. et al. 쥐의 운동 피질에서 레이저로 인한 뇌 손상. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 쥐의 레이저 유도 뇌 손상 후 혈액 뇌 장벽(BBB) 무결성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 추적 염료를 꼬리 정맥에 주입하여 뇌로 순환하고 손상된 BBB를 통해 조직으로 누출되도록 합니다. 그런 다음 뇌를 추출하고 가공하여 염료를 방출합니다. 염료의 형광 강도는 레이저로 인한 BBB 손상의 정도를 정량화하기 위해 측정됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 레이저 유발 뇌 손상 실험 절차

1. 레이저 그룹으로 표시된 그룹에 20마리의 쥐를 할당하고 다른 대조군(가짜 작동)에 20마리의 쥐를 할당합니다.
2. 레이저 그룹 쥐에게 다음과 같은 방식으로 50J X 10 포인트에서 레이저 방사선 조사를 실시합니다.
   1. 산소에 2% 이소플루란을 혼합하여 쥐를 마취시켜 자발적 환기를 가능하게 합니다. 집게로 꼬리를 꼬집어 충분한 마취 깊이를 확인하여 금단 반사가 없는지 확인합니다.
   2. 면도기로 현지 머리카락을 제거하고 70% 알코올과 0.5% 클로르헥시딘 글루코네이트로 소독합니다. 소독 단계를 두 번 더 반복합니다.
      참고: 수술 절개 부위의 크기는 약 3cm여야 합니다. 절개 부위 주위로 최소 2cm 떨어진 털을 제거합니다.
   3. 엎드린 자세로 입체 머리 홀더에 쥐를 놓고 두피를 측면으로 반사하고 Bregma와 Lambda 사이의 영역을 노출시키기 위해 3cm를 절개합니다.
   4. 코콘을 통해 마취를 유지합니다.
   5. 네오디뮴 도핑된 이트륨 알루미늄 가넷(Nd-YAG) 레이저(피크 파장 1064nm)를 사용하여 우반구 위의 두개골 노출 영역에 1초 펄스 지속 시간으로 50J X 10 포인트를 투여합니다.
   6. 레이저 빔을 생성하기 위해 장치의 레이저 생성 부분이 노출 영역으로부터 2mm 거리에 있는지 확인하십시오. 50J X 10 포인트는 다양한 에너지/표면 조합을 주의 깊게 평가한 후 선택되었습니다. 이 조합은 효율적이며 투여 후 1초 미만 동안 두개골의 뼈 파괴를 일으키지 않습니다.
      참고: 2mm는 레이저 빔의 단자(통과하는 광 케이블에서)와 두개골 뼈 사이의 거리입니다. 포커싱 렌즈를 사용하는 경우 원하는 손상 영역에서 빔의 초점을 맞추기 위해 렌즈의 경사각을 고려하여 거리를 계산해야 합니다. 레이저 장치를 사용할 때 적절한 교육 및 눈 보호를 포함하여 적절한 안전을 보장하십시오.
   7. 장치에서 쥐를 제거하고 3-0 실크 수술용 봉합사로 두피를 닫습니다.
   8. 마취를 중단하고 쥐를 회복을 위해 새장으로 되돌려 놓습니다. 수술 직후 통증을 줄이기 위해 0.25% 부피바카인 0.1mL를 국소적으로 투여합니다.
      참고: 올바르게 수행된 경우 전체 절차는 5분 미만으로 지속되어야 합니다.
3. 마취 후 회복 중 쥐에게 고통의 징후가 있는지 관찰하십시오. 마취에서 벗어나기 전에 수술 후 진통제를 위해 0.01mg/kg 근육 내 부프레노르핀을 투여하고 최소 48시간 동안 12시간마다 반복 투여를 계속합니다.
4. 피험자는 레이저를 가하지 않고 쥐를 동일한 조건으로 제어합니다.

2. 신경학적 중증도 점수(NSS)

1. 43점 점수를 사용하여 레이저로 인한 뇌 손상 후 24시간 후에 신경학적 중증도 점수를 평가합니다. 동물의 신경학적 결손, 행동 장애, 빔 밸런싱 작업 및 반사 신경을 테스트하고 더 심각한 장애에 대해 더 높은 점수를 할당합니다.

3. 뇌 손상

1. 평가Determining the extent of blood-brain barrier (BBB) breakage
   참고: 다음과 같이 레이저로 인한 뇌 손상 후 24시간 후에 BBB 파손을 평가합니다:
   1. 4mL/kg 식염수와 혼합된 2% Evans Blue를 캐뉼레이션 꼬리 정맥을 통해 쥐에게 정맥 주사하고 용액이 1시간 동안 순환하도록 합니다.
   2. 마지막 NSS 후 24시간 후에 쥐를 20% 산소와 80% CO₂(영감을 통해)에 노출시켜 안락사시킵니다.
   3. 다음과 같이 혈관 내 국소 염료를 수확합니다.
      1. 수술용 핀셋과 수술용 가위로 쥐의 가슴을 엽니다.
      2. 우심방에서 무색의 관류 액체를 얻을 때까지 110mmHg를 사용하여 좌심실을 통해 냉각된 0.9% 식염수로 동물을 관류합니다.
   4. 왼쪽 뇌 절편과 오른쪽 부분을 분리하여 손상된 반구와 다치지 않은 반구를 별도로 평가합니다.
   5. 박격포와 절굿공이를 사용하여 무게를 측정하고 균질화한 다음 24시간 동안 50% 트리클로로아세트산에서 뇌 조직을 배양합니다.
   6. 균질화된 뇌 절편을 10,000 × g에서 20분 동안 원심분리합니다.
   7. 참고: 두 그룹의 쥐는 BBB 분해를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 거칩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50% 트리클로로아세트산	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
디지털 저울	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
해부 가위	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884 <
SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
에탄올 96 %	ROMICAL		가연성 액체
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
형광 검출기	Tecan, Männedorf Switzerland	모델 Infinite 200 PRO 다중 모드 리더
온도계가 있는 히터	Heatingpad-1	모델: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
이소플루란, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
멀티셋	TEVA MEDICAL	998702
올림푸스 BX 40 현미경	올림푸스
페트리 접시	SIGMA - ALDRICH	P5606
메스 블레이드 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (네오디뮴 도핑 이트륨 알루미늄 가넷) 레이저 기계	Laser Industries Ltd
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