내피 세포에서 밀접한 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화(Fluorescence Localization of tight junction proteins and stress fibers in endothelial cells)

초록

출처: Alluri, H., et al. 혈액-뇌 장벽 기능 장애 연구를 위한 체외 허혈-재관류 손상 모델로서의 산소-포도당 결핍 및 재산소화. J. Vis. Exp. (2015).

이 비디오는 쥐의 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)에서 밀접 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화를 보여줍니다. 스트레스 단층에서는 형광 표지된 항체를 사용하여 밀착 접합 단백질을 표지하고, 형광단 표지된 팔로이딘은 응력 섬유를 표지합니다. 그런 다음 표지된 분자는 컨포칼 현미경을 통해 시각화됩니다.

프로토콜

1. 내피 세포의 파종

1. 성체 Sprague Dawley 쥐에서 RBMEC의 1차 배양을 얻습니다(또는 상업적으로 획득).
2. 쥐 뇌 내피 세포 성장 배지를 사용하여 100cm 피브로넥틴(50μg/ml) 코팅된 페트리 접시에서 RBMEC을 배양합니다. 포화도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오.
3. 80-90% 농도에 도달하면 소용돌이치며 5ml 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 세포를 37°C로 평형을 이루는 따뜻한 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 1ml에 노출시켜 세포를 분리합니다.
4. 세포가 분리되고 분산될 때까지 37°C에서 2-5분 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 배양 접시를 두드려 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 접시 표면에서 세포가 완전히 분리되었는지 확인합니다.
5. 트립신을 중화하기 위해 페트리 접시에 5ml의 완전한 배지를 추가합니다. 분리된 세포가 포함된 배지를 피펫으로 빼내고 15ml 원심분리 튜브에 수집합니다.
6. 내피 세포가 포함된 배지를 220 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
7. 상등액을 흡인하고 세포를 포함하는 펠렛을 보존합니다. 펠릿을 피펫과 함께 위아래로 부드럽게 혼합하여 3-5ml의 신선한 쥐 뇌 내피 세포 성장 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
8. 세포 현탁액을 피브로넥틴(50μg/ml) 사전 코팅된 8웰 멸균 챔버 슬라이드 시스템, 0.7cm로 옮깁니다²/웰. 합류점이 이루어질 때까지 37 °C에서 세포를 성장시킵니다
   참고: 웨스턴 블롯 또는 기타 실험을 수행하기 위해 실험에 필요한 10cm 세포 배양 접시 또는 특수 접시에서 세포를 성장시킬 수 있습니다.

2. 산소 및 포도당 결핍-재산소화(OGD-R) 체외 모델

1. 저산소증 세포 배양 시스템을 사용하여 RBMEC에 대한 OGD-R의 효과를 연구합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>그림 1). 제조업체의 지침에 따라 실험을 시작하기 전에 저산소증 세포 배양 시스템을 설정하고 보정합니다.
2. 37°C 인큐베이터에서 confluent chamber 슬라이드(step 1.8)를 제거합니다. 챔버 슬라이드의 전체 매체를 탈산소화, 포도당 없음, Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)으로 교체하고 저산소증 챔버에 95%로 배치합니다. N₂ 및 5% CO₂ 37°C에서 2시간 동안 OGD 조건을 나타냅니다.
3. 95% O₂, 5% CO₂하고 신선한 쥐의 뇌 내피 세포를 제공하고 배지를 완성하고 37 °C에서 1 시간 동안 더 배양합니다.
   참고: 이 단계 재산소 상황을 나타냅니다.
4. 면역형광 국소화 및 로다민 팔로이딘 라벨링을 위해 챔버 슬라이드를 사용합니다(섹션 3 참조).

3. 면역형광 zonula occludens-1 (ZO-1) 및 필라멘트 액틴의 국소화 (f-actin) Rhodamine Phalloidin을 사용한 라벨링

1. RBMEC 단층이 포함된 챔버 슬라이드를 100μl의 opti-MEM/감소된 혈청 매체/웰에 1시간 동안 노출시킵니다. 챔버 슬라이드를 100μl의 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.0-7.2)로 3회 세척합니다.
2. PBS(pH 7.0-7.2)에서 100μl의 4% 파라포름알데히드를 사용하여 셀을 15분 동안 고정하고 PBS(pH 7.0-7.2)에서 챔버 슬라이드를 3회 더 세척합니다.
3. PBS(pH 7.0-7.2)에서 0.5% Triton X-100 100μl를 사용하여 15분 더 세포를 투과합니다. PBS에서 100μl의 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 한 시간 동안 차단합니다. 이 단계가 끝나면 ZO-1 또는 f-actin.
   1. 면역형광 염색을 위해 4°C에서 하룻밤(O/N) 동안 2% BSA-PBS로 준비한 ZO-1에 대한 항토끼 1차 항체로 세포를 1:150에 배양합니다. PBS(pH 7.0-7.2)에서 세포를 3회 세척합니다. 100μl의 Fluorescein isothiocyanate(FITC) 태그가 지정된 항토끼 2차 항체를 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. Rhodamine Phalloidin 라벨링의 경우 차단 후 2% BSA-PBS로 준비된 100μl의 로다민 팔로이딘에 20분 동안 세포를 노출시킵니다.
   3. PBS(pH 7.0-7.2)에서 면역형광 염색 및 로다민 팔로이딘 표지로부터 세포를 세척합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 함유된 퇴색 방지 시약이 포함된 장착 매체를 사용하여 챔버를 장착합니다.
4. 60X Water Immersion Lens를 사용하여 세포를 시각화하고 컨포칼 현미경으로 단일 광학 평면에서 세포를 스캔합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary 항체	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	사용 가능한 다른 PBS를 사용할 수 있습니다

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