신경 줄기 세포 활성화 및 이동을 연구하기 위한 최소 척수 손상 모델

초록

출처: Lakshman, N., et al. 최소한의 척수 손상의 마우스 모델에서 내인성 신경 줄기 세포 활성화를 평가하기 위한 신경구 분석. J. vis. 특급 (2018).

이 비디오는 쥐 척수 손상 모델에서 신경 줄기 세포(NSC)의 활성화 및 이동을 보여줍니다. 척수를 노출시키기 위해, 마취된 마우스에서 척추의 흉부 부위에서 척추를 제거합니다. 그런 다음 구부러진 바늘을 사용하여 척수의 백질에 표면 손상을 만들어 중심관을 보존합니다. 부상 후 운하를 둘러싼 NSC가 활성화되고 조직 복구를 돕기 위해 부상 부위로 이동합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Minimal Spinal Cord Injury Surgery

참고: 수술 전에 모든 수술 기구와 재료가 적절한 방법으로 멸균되었는지 확인하십시오(그림 1A).

1. 4-5개의 거즈를 말아서 중간에 테이프로 붙여서 고정된 거즈 롤을 얻어 흉부 지지 아치를 만듭니다.
2. 마우스를 유도실에 넣고 5% 이소플루란으로 마취를 시작합니다. 진행하기 전과 절차 전반에 걸쳐 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하십시오. 수술이 완료되는 데 30분 이상 소요될 수 있으므로 이소플루란 노출을 최소화하도록 최적화합니다(5%에서 5분, 나머지 시간은 2-3%).
3. 2-3%의 이소플루란 유지 용량으로 마취 기계에 부착된 콧방울로 마우스를 옮깁니다. 이발기를 사용하여 등 중앙에서 목/귀까지 동물의 등쪽에서 털을 제거하여 수술을 위해 넓은 직사각형 피부 영역을 노출시킵니다.
4. 복강내 수술 전 진통제 투여 — Meloxicam (2.0 mg/kg). 마취 상태에서 각막 건조를 방지하기 위해 뜨고 있는 마우스 눈에 눈 윤활제를 넉넉하게 바르십시오.
5. 흉부 지지궁을 쥐 복부 아래에 놓고 꼬리 밑부분을 가볍게 당겨 쥐의 몸통과 척추를 곧게 펴십시오. 실험실 라벨링 테이프를 사용하여 꼬리와 확장된 모든 팔다리를 별 모양의 위치에 고정합니다. 일단 고정되면 흉추를 지지하기 위해 쥐 복부에서 상부 흉부 쪽으로 흉곽 지지궁을 가로로 밀어 넣습니다(그림 1B).
6. 1.3단계에서 준비한 털이 잘린 피부 부위를 70% 에탄올로 소독한 다음 포비돈 요오드를 투여하여 무균 수술 부위를 준비합니다. 두 번 반복합니다. 넓은 멸균 영역을 유지하기 위해 멸균 수술용 드레이프를 적용합니다.
7. #10 메스 날을 사용하여 양쪽 견갑골의 중간 지점에서 흉추의 곡률까지 동물의 세로축과 평행하게 수직 절개를 만듭니다. 피부를 수축시켜 연조직과 척추 윤곽을 노출시킵니다(그림 1C).
8. 견갑상지방패드의 아래쪽 테두리를 식별합니다(T4/5 척추 수준을 구분합니다). 동일한 #10 칼날로 조심스럽지만 힘을 주어 척추뼈 T5–T8/9의 양쪽을 따라 절단하여 기둥에서 등 근육 힘줄을 분리합니다.
9. 척추 양쪽의 절개 부위에 견인기의 치아를 삽입합니다. 수축된 근육층에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추를 충분히 들어 올릴 수 있도록 견인기를 확장하여 노출을 조정합니다(그림 1D).
10. 수술용 현미경으로 척추 위에 있는 잔여 근육 및 기타 연조직을 조심스럽게 청소하여 척추뼈를 노출시킵니다(그림 1E). 척추뼈의 가시돌기를 톱니가 있는 집게로 잡고 약간 위아래로 움직여 제거할 척추뼈를 식별합니다.
    참고: 이렇게 하면 추간 관절을 식별할 수 있고 관심 척추 아래의 작은 구멍(추간공)이 노출됩니다.
11. 구부러진 뭉툭한 가위의 머리 하나를 노출된 추간공의 양쪽에 삽입하고, 절제할 척추판의 꼬리쪽을 삽입하고, 연결하는 추간극을 양측으로 자릅니다.
12. 층을 위로 들어 올리고 층판의 위쪽 부착물을 잘라내어 뼈를 분리하고 제거합니다.
    참고: 이것은 척수를 포함하는 손상되지 않은 경막낭을 노출시킵니다(그림 1F). 과도하게 출혈이 있을 수 있으며, 이는 미리 절단된 1cm x 1cm 거즈를 환부에 바르거나 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 조절할 수 있습니다.
13. 등쪽 정중선 정맥을 랜드마크 역할을하면서 30G 바늘 끝(바늘 베벨이 위쪽을 향함)의 45° 구부러진 샤프트를 정중선 양쪽 측면으로 약 0.5mm 측면에서 척수의 배외측 표면(약 1mm 깊이)에 삽입합니다.
14. 바늘을 꼬리에서 꼬리까지(정중선과 평행하게) ~2mm 움직여 바늘 베벨의 전체 길이가 코드에 삽입되도록 합니다. 진입 경로를 통해 다시 추적하여 바늘을 제거합니다(그림 1G).
    참고: 출혈은 없어야 하지만 이 단계에서 척추 조직의 부기가 보일 수 있습니다.
15. 상처를 봉합하려면 견인기를 제거하고 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 부상 부위 양쪽의 등 근육을 정중선에서 함께 봉합합니다. 4-0 멸균 실크 봉합사를 사용하여 위에 있는 피부를 봉합합니다.

결과

그림 1: 수술 절차. (A) 참조용으로 번호가 매겨진 필요한 모든 것의 레이아웃입니다. (B) 곧게 펴진 몸체, 척추 및 팔다리가 펼쳐지고 아래에 배치된 흉부 지지 아치와 함께 테이프로 감겨진 입체 장치에 있는 마우스의 사진. (C) 근육층과 척추 윤곽을 노출시키는 수직 피부 절개를 가진 쥐의 사진. (D) 근육 절개 후 견도체로 척추를 노출시키고 격리한 쥐 몸의 사진. 찢어짐이 없는 팽팽한 근육층에 유의하십시오. (E) 근육층이 제거된 고립된 쥐 척추의 사진으로, 척추뼈의 뼈 표면(3개 분절)을 보여줍니다. 이것은 또한 가시돌기와 아마도 제거되어야 할 중간 척추...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff 스프링 가위 (곡선)	Fine Science Tools	15370-50	Customize when ordering to get duunted tips
Graefe Forceps (Straight, 1x2 teeth)	Fine Science Tools	11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)	Fine Science Tools	11152-10	또는 봉합
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	또는 봉합
메스 손잡이 #3	Fine Science Tools	10003-12	또는 다른 적절한
Hair clippers	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	또는 기타 적절한
Stereotaxic instrument	Stoeling	51500	또는 기타 적절한
Meloxicam			또는 동물 보호 시설
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	또는 기타 적절한
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	또는 마취에 적합한 기타 어떤 것
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze	Fisher Scientific	13-761-52
30G 바늘	Becton Dickinson	305106	부상
25G 바늘	Becton Dickinson	305122	약물 주사
1mL 주사기	Becton Dickinson	3090659	for drug injections
3mL Syringes	Becton Dickinson	309657	for fluid injections
4-0 Suture	uoftmedstore.com	2297-VS881	피부 봉합
6-0 봉합	uoftmedstore.com	VS889	근육 봉합
표준 해부 도구	Fine Science Tools
Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000

을 위한 다른 겸자에 적합한 기타에서 승인한 적절한