인간이 아닌 영장류 뇌 조직에 대한 면역조직화학 수행

초록

출처: Eid, L. & Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017).

이 비디오는 전자 현미경을 위한 사전 임베딩 면역조직화학을 사용하여 알데히드가 고정된 비인간 영장류 뇌 조직의 준비를 보여줍니다. 특정 신경 단백질에 대한 면역 표지 단계를 간략하게 설명한 다음 착색된 침전물을 생성하는 과산화효소 반응을 통해 전자 현미경에서 표적 단백질을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 사전 포매딩 면역조직화학(그림 1C)

1. 다음과 같이 Tris-buffered Saline(TBS, 50 mM, pH 7.6)의 4 L 원액을 준비합니다.
   1. 4L 비커에 증류수 2L를 측정하고 트리하이드록시메틸 아미노메탄(THAM; C₄H₁₁NO₃)을 넣고 저어 녹입니다.
   2. 약 148mL의 1N HCl을 사용하여 pH를 7.6으로 조정합니다. pH가 7.6 미만에 도달하지 않도록 산을 주의해서 추가해야 합니다. 총 부피는 4L이어야 합니다.
      주의: HCl은 부식성이 매우 높습니다. 적절한 PPE를 착용하십시오.
2. EM 면역조직화학을 위해 처리할 관심 영역이 포함된 섹션을 선택합니다.
3. 부동액을 헹구기 위해 PBS(0.1M, pH 7.4)에서 3x PBS(0.1M, pH 7.4)로 5분 동안 세척합니다.
4. PBS에 희석된 NaBH₄ 0.5% 용액을 준비합니다.
   1. 0.05g의 NaBH₄의 무게를 측정하고 PBS 10mL에 희석합니다. 덮지 마십시오. 사용 직전에 이 용액을 준비하십시오.
5. 갓 준비한 NaBH₄ 용액의 섹션을 RT에서 30분 동안 배양합니다. 부드럽게 흔듭니다. 덮지 마십시오.
6. RT에서 3분 동안 PBS로 10회 세척하고 반응 가스가 남지 않을 때까지 세게 흔듭니다. 위치
7. PBS에 희석된 2%의 적절한 일반 혈청과 0.5%의 차가운 생선 젤라틴으로 EM을 위한 차단 용액을 준비합니다.
   참고: 다음 세 단계를 위해 충분한 양을 확보하기 위해 수량을 계산해야 합니다. 2차 항체를 숙주하는 동일한 동물 종으로 만든 혈청을 사용하십시오.항원 회수 방법의 사용이나 소량의 트리톤을 추가(항체 침투를 증가시키기 위해)는 조직의 품질을 크게 손상시키므로 피하십시오.
8. RT에서 1시간 동안 차단 용액의 섹션을 배양합니다. 부드럽게 흔듭니다.
9. 차단 용액에 희석된 1차 항체 용액을 준비합니다.
   참고: 1차 항체의 농도는 일반적으로 LM 면역조직화학의 농도와 동일하지만, 일부 1차 항체는 아크롤레인과 함께 작용하지 않을 수 있으므로 사전에 다른 항체 농도로 검사를 수행하는 것이 좋습니다. 그렇다면, 트랜스 맥 관류를 위해 글루타르알데히드(0.1 - 2%)와 4% PFA를 혼합하여 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 배양 시간과 온도도 최적화합니다.
10. 1차 항체 용액의 절편을 RT에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 이전에 테스트된 배양 시간과 온도를 사용하십시오.
11. 부드러운 흔들림으로 RT에서 5분 동안 PBS에서 섹션을 3번 씻습니다.
12. 차단 용액에 희석된 비오틴화된 2차 항체의 1:1,000 용액을 준비합니다.
    참고: 2차 항체는 1차 항체를 생성하는 데 사용되는 숙주 종에 대해 발생해야 합니다.
13. 2차 항체 용액에 절편을 RT에서 1.5시간 동안 배양합니다. 부드럽게 흔듭니다.
14. 2차 항체 배양이 끝나기 최소 60분 전에 avidin-biotin-peroxidase(ABC) 용액을 준비합니다.
    1. 보정된 피펫을 사용하여 8.80μL/mL의 용액 A 및 B를 측정하고 PBS로 희석합니다.
    2. 아비딘과 비오틴 분자 사이의 완전한 결합을 허용하기 위해 RT에서 최소 60분 동안 가볍게 흔듭니다.
15. 2차 항체 용액에서 배양한 후 RT에서 10분 동안 PBS에서 3회 세척합니다.
16. ABC 용액의 절편을 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 부드럽게 흔듭니다.
17. PBS에서 한 번, TBS에서 두 번 RT에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 세탁합니다.
18. TBS에 희석된 0.005% H₂O₂와 함께 0.05% 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)의 새 용액을 준비합니다.
    1. 12.5mg의 무게를 달아 차가운 TBS 25mL에 희석합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
       주의: DAB 분말은 휘발성이 높으며 흡입하면 유해합니다. 그것은 발암 성 및 기형 유발 성입니다. 따라서 임산부 또는 수유 중인 여성은 희석된 경우에도 이 제품을 조작해서는 안 됩니다. 조작할 때는 N95 마스크를 사용하고 PPE를 착용하십시오.
    2. 용액을 여과하고 사용 직전에 30% H₂O₂ 4.5μL를 추가합니다.
19. RT에서 3-7분 동안 DAB 용액의 절편을 배양합니다. 부드럽게 흔듭니다.
    참고: 갈색 침전물은 높은 수준의 배경 염색을 피하기 위해 너무 어둡지 않아야 합니다. 그에 따라 배양 시간을 최적화해야 합니다.
20. 차가운 TBS에서 빠르게 두 번 세척한 다음 RT에서 차가운 TBS에서 10분 동안 두 번, PB에서 10분 동안 두 번 가볍게 흔들림으로 반응을 중지합니다.
    참고: NaCl의 흔적을 제거하기 위해서는 PB(PBS가 아님)를 사용하는 것이 중요하며, NaCl은 오스뮴과 반응하여 결정을 형성하기 때문입니다.

결과

그림 1: 프로토콜의 필수 단계에 대한 개략도. 원숭이 뇌(A)는 냉각 진동(B)으로 연속된 부분으로 절단됩니다. 그런 다음 사전 임베딩 면역조직화학 및 전자 현미경을 위해 처리된 후 관심 영역을 수지 블록(C)의 끝에 놓고 초박절기(D

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이염기성 무수 인산나트륨	피셔 사이언티픽	S374-500
monobasic monohydrate sodium phosphate	EM 사이언	SX0710-1
염화나트륨(NaCl)	피셔 사이언티픽	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	피셔 사이언티픽	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 약과 함께 사용하십시오.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 보호 장치와 함께 사용하십시오.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 주의해서 사용하십시오.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% 희석. 제품은 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 사용하십시오.
Autopsy venting table	mopec	CE400
전자 관류 펌프	cole parmer	masterflex l/s 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
바늘	terumo	NN-2713R	21G 1/2
ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	깃털 창	201011 J9913	수술 22번, EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	장치가 허용하는 경우 매번 사용하기 전에 블레이드를 보정합니다.
Vibratome razor blade	질레트	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% 희석
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
차가운 생선 젤라틴	Aurion	900.033	0.5% 희석. 원래 제품은 40%
1차 항체, SERT	산타크루즈 생명공학	SC-1458	1/500 dilution
1차 항체, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
1차 항체, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 희석
biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain 엘리트 ABC kit	Vector 연구소	PK6100	8.8 μL/mL of A와 B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	시그마	D5637	0,05% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 싱크대에 쓰레기를 버리지 마세요.
과산화물 30%	피셔 사이언티픽	H-323	0,005% 희석

스='height:19px;' >< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Sodium borohydride