미세아교세포와 뉴런을 위한 쥐 코로나 조직 동결절편의 면역조직화학적 염색

초록

출처: Evilsizor, M. N., et. al., 저온 절개 쥐 뇌 조직에 대한 면역 조직 화학을 위한 프라이머: 미세아교세포 및 뉴런에 대한 염색 예. J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 미세아교세포와 뉴런의 공간 배열을 시각화하기 위해 동결절제된 쥐 뇌 조직에 대한 단계별 면역조직화학 염색 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 조직 염색
   1. 빛이 새지 않는 염색 상자에 탈이온수를 적신 보푸라기가 없는 조직으로 "습도 챔버"를 만듭니다.
   2. 보푸라기가 없는 티슈로 슬라이드의 가장자리를 말리고 미니 파펜을 사용하여 티슈 섹션에서 멀리 떨어진 슬라이드 가장자리에 방수 테두리를 만듭니다. 이 경계는 액체의 반월판과 조직의 가장자리 사이에 충분한 공간을 확보하여 표면 장력이 염색에 영향을 미치지 않도록 해야 합니다.
      참고: pap 펜 구충제 테두리는 관심 항체가 마이크로파 항원 회수를 필요로 하지 않는 경우 1.1.3 이전에 적용할 수 있습니다. PBS에서 세탁하기 전에 파펜을 적용한 경우 이 단계에서 발수 테두리의 무결성을 확인해야 합니다. 미니 팝 펜을 사용하여 테두리의 틈을 채웁니다.
   3. 슬라이드를 수평으로 놓고 PBS(블록 용액)에서 4% v/v 혈청을 배양하여 비특이적 항원 결합을 차단합니다. 실온에서 1시간 동안 슬라이드당 300μl의 블록 용액을 피펫팅합니다. 블록 용액이 슬라이드 가장자리의 팹 펜까지 확장되고 조직 근처의 표면 장력으로 인한 고르지 않은 얼룩을 방지하기 위해 조직을 완전히 덮는지 확인하십시오.
      1. 2차 항체가 만들어지는 것과 동일한 종의 혈청을 사용하십시오. 참고: 이 절차에서는 2차 항체가 당나귀에서 만들어지므로 당나귀 혈청이 사용됩니다. 2개 이상의 서로 다른 종의 2차 항체를 사용하는 경우, 각 종의 혈청을 포함하십시오.
   4. 1차 항체를 슬라이드에 피펫팅합니다. 참고: 이 염색을 위한 항체 농도는 Iba1 및 Pan-neuronal에 대해 각각 1:5,000 및 1:500으로 최적화되었습니다. 이러한 농도는 배경 염색 없이 의미 있는 염색을 보여주는 것으로 밝혀졌습니다.
      1. 블록 용액을 PBS의 1% 혈청으로 희석하고 1차 항체를 첨가합니다. 슬라이드당 1% 혈청에 300μl의 1차 항체 용액을 피펫팅합니다. 다시 말하지만, 액체가 자궁 펜의 가장자리에 있는지 확인하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      2. Iba1 또는 범신경 항체가 없는 슬라이드, 범뉴런 항체가 없는 Iba1 슬라이드, Iba1이 없는 범뉴런 항체 슬라이드. 동일한 실행에서 동일한 용액으로 이러한 슬라이드를 염색하되, 2차 항체의 비특이적 결합을 테스트하기 위해 1차 항체를 생략합니다.
   5. 다음 날 아침, PBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척하고 세척 사이에 용액을 변경합니다.
   6. 형광 항체는 빛에 민감하므로 이 단계부터 세척 용기를 호일로 감싸고 혼성화 상자를 검은색으로 하거나 어두운 곳에서 배양하여 빛 노출을 최소화합니다. 모든 슬라이드에 적절한 2차 항체를 피펫팅하고 빛이 새지 않는 "습도 챔버"(1.2.1 단계 참조)에서 블록 용액(1.2.3 단계 참조)의 1:250 농도로 실온에서 60분 동안 배양합니다.
      1. 다른 파장의 2차 항체를 사용하십시오. 여기서, 1차 항체인 rabbit anti-Iba1의 경우, donkey anti-rabbit 594를 적절한 2차 항체로 사용합니다. 1차 항체 마우스 항범뉴런의 경우 당나귀 항 마우스 488을 적절한 2차 항체로 사용합니다. 또는 안티 래빗 488 및 안티 마우스 594를 사용하십시오.
   7. PBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다.
   위치
   8. 선택 사항: 핵 염색을 수행합니다.
      1. 이중 증류된 H₂O에 0.03μg/ml 농도의 Hoechst(또는 기타 핵 염색)에 정확히 60초 동안 놓습니다.
      2. PBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다.
   9. ddH₂O.
2. 커버슬립
   1. Fluoromount-G 또는 ProlongGold와 같은 수성 장착 매체로 커버슬립 슬라이드. 면봉 애플리케이터를 사용하여 모든 거품을 제거하도록 주의하십시오.
      참고: 다른 장착제를 사용할 수 있지만, 일부 사람들은 커버슬립 후 며칠 이내에 염료 사이의 높은 블리드 스루를 발견했습니다.
   2. 투명한 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하여 증발로 인해 섹션이 건조되는 것을 방지합니다. 매니큐어는 슬라이드가 평평하게 유지되고 실온에서 빛이 새지 않는 용기에서 건조시킨 다음 4°C에서 호일로 싸인 방광용기에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료/장비 이름
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides	Fisher Scientific	22-034-979	조직 장착에 사용
오븐	Thermo Scientific	51028112
미니 파펜	라이프 테크놀로지스	00-8877
앤드윈 사이언티픽 티슈-텍 슬라이드 염색 접시	피셔 사이언티픽	22-149-429	염색 중 모든 세척에 사용, Hoechst 단계
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	슬라이드 건조에 사용
블랙 염색 상자	Ted Pella	21050	블로킹 및 염색 단계에 사용
노멀 당나귀 혈청	피셔 사이언티픽	50-413-253	블록 및 항체 배양에 사용
마우스 α-범뉴런	밀리포어	MAB2300	1차 항체에 사용
토끼 α-IBA1	와코화학{{TAG_ 103}}	019-19741	1차 항체에 사용
당나귀 α-토끼 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	2차 항체에 사용
당나귀 α-mouse 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	2차 항체에 사용 항체
플루오로마운트-G	서던 바이오텍	0100-01	커버 슬립에 사용
커버 슬립	Fisher Scientific	12544E	커버 슬립에 사용
Axio Observer.Z1 및 LSM 710 (레이저 스캐닝, 컨포칼)	칼 자이스	해당 없음	이미징에 사용
Axioskop A2	칼 자이스	N/A	이미징에 사용

{{TAG_ 36}}조직 건조에 사용 {{TAG_ 79}}