뇌종양 신경구 절편에서 바이오마커의 면역조직화학적 염색

초록

출처: Núñez, F. J., et al. 파라핀 함유 3D 신경교종 신경구 배양에 대한 면역조직화학에 의한 신경교종의 바이오마커 평가. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 파라핀이 포함된 뇌종양 신경구에서 종양 바이오마커를 라벨링하기 위한 면역조직화학 기술을 보여줍니다. 신경구 절편은 파라핀 제거 및 재수화 과정을 거친 후 바이오마커 부위를 노출시키는 치료를 받습니다. 그런 다음 1차 및 2차 항체를 적용하여 이러한 바이오마커를 라벨링합니다. 2차 항체는 아비딘 접합 과산화효소(avidin-conjugated peroxidase enzyme)에 결합되어 있으며, 이 효소는 발색 기질을 산화시켜 바이오마커 위치를 나타냅니다. 마지막으로, 현미경 분석을 위해 핵 counterstaining 및 slide preparation이 완료됩니다.

프로토콜

1. 파라핀 포매 신경구(NS)의 면역조직화학(IHC)

1. 슬라이드를 금속 랙에 넣고 60°C에서 20분 동안 배양하여 파라핀을 녹입니다.
2. 실온(RT)에서 재수화 트레인에서 배양하여 슬라이드를 탈파라핀화합니다. 3x 크실렌 5분, 100% 2x 에탄올 2분, 95% 2x 에탄올 2분, 70% 1x 에탄올 2분, 1x 탈이온수 2분. 이제, 건조되면 비특이적 항체 결합이 발생하므로 항원 회수가 있을 때까지 슬라이드를 수돗물에 보관하십시오.
3. 시트를 시트르산 완충액(10mM 구연산, 0.05% 비이온 세제, pH 6)에서 125°C에서 30초 동안, 90°C에서 10초 동안 배양합니다. 식힌 다음 증류수로 슬라이드를 5번 헹굽니다.
4. 상온에서 슬라이드를 0.3% H₂O₂ 에서 30분 동안 배양합니다.
5. 세탁 버퍼(트리스 완충 식염수[TBS]에 0.025% 세제)를 넣고 부드러운 교반으로 5분 동안 슬라이드를 3회 세척합니다.
6. RT에서 차단 용액(10% 말 혈청, TBS의 경우 0.1% 소 혈청 알부민[BSA])으로 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.
7. 희석 용액(TBS의 경우 0.1% BSA)으로 준비된 1차 항체와 함께 가습 챔버에서 4°C에서 하룻밤 동안 슬라이드를 배양합니다. 세탁 버퍼에 슬라이드를 넣고 부드럽게 저으면서 5분 동안 3회 세탁합니다.
8. 희석 용액에서 준비된 비오틴화된 2차 항체로 RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 세탁 버퍼에 슬라이드를 넣고 부드럽게 저으면서 5분 동안 3회 세탁합니다.
9. 어둠 속에서 RT에서 avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex로 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 세탁 버퍼에 슬라이드를 넣고 부드럽게 저으면서 5분 동안 3회 세탁합니다.
10. RT에서 2-5분 동안 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)-H₂O₂ substrate 브랜드로 슬라이드를 배양합니다.
11. 수돗물로 3번 헹굽니다. 슬라이드를 헤마톡실린 용액에 담궈 (1-2 s) 얼룩을 제거한 다음 맑아질 때까지 수돗물로 철저히 헹굽니다.
12. 증류수에서 2분 동안 배양하고, 80% 에탄올에 3회 담그고, 95% 에탄올에서 각각 2분 동안 2회 배양하고, 100% 에탄올에서 각 2분 동안 2회 배양하고, 마지막으로 크실렌에서 3회 각각 3분 동안 배양합니다.
13. 자일렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 덮고 이미징할 준비가 될 때까지 RT에서 평평한 표면에서 건조시킵니다.

참고: DAB 염색을 수행하는 경우 슬라이드를 RT에 보관할 수 있습니다. 그러나 면역형광 염색을 수행하는 경우 슬라이드는 광표백을 줄이기 위해 -20°C의 어두운 곳에 보관해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
토끼 다클론 항-ATRX,	산타크루즈 생명공학	sc-15408	IHC, 1:250 희석
토끼 다클론 항-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 희석
토끼 다클론 항-OLIG2	밀리포어	AB9610	IHC, 1:500 희석
염소 다클론 항 토끼 비오틴 접합	Dako	E0432	IHC, 1:1000 희석
Vectastain Elite ABC HRP 키트	Vector Laboratories Inc	PK-6100
베타조이드 DAB 발색 키트{{TAG_ 61}}	바이오케어 메디컬	BDB2004 L/가격 12/18까지