Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood(인간 말초 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장)의 제조

초록

이 동영상은 혈소판 수 스크리닝, 혈액 채취 및 원심분리, 혈소판 분리를 통한 고품질 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 준비를 보여줍니다. 이 PRP는 조직 재생 및 치유를 위한 치료 응용 분야에 사용됩니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 샘플 수집

1. 혈소판 감소증을 배제하고 기준선 세포 수를 설정하기 위해 예비 혈구 수를 사용하여 환자를 스크리닝합니다. 이를 위해 세포 계수를 위해 임상 등급의 혈구계를 사용하십시오. 혈소판 수가 150,000 cells/μL 이상인지 확인합니다.

2. 검체 채취 전에 환자에게 수분을 충분히 공급해야 합니다. 이것은 혀, 피부 거칠기 및 혈압 측정에 대한 육안 검사를 통해 보장할 수 있습니다.

3. 5mL의 ACDA(Acid-Citrate-Dextrose-Adenine) 항응고제로 채워진 2 x 50mL 주사기를 사용하여 환자의 전후 정맥에서 100mL의 말초 정맥 혈액을 1:10의 비율로 수집합니다. 수집된 주사기를 기울여 항응고제의 적절한 혼합을 위해 혈액 샘플의 응고를 방지하기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 기다립니다.
   참고: 채혈이 느리면 수집된 혈액과 항응고제 및 응고가 부적절하게 혼합될 수 있으므로 채혈을 위해 최소 18G의 캐뉼라를 사용하십시오.

4. 주사기에 있는 혈액 100mL를 각 튜브에 10mL가 있는 15mL 원추형 바닥 원심분리 튜브로 옮깁니다.

2. 원심분리 및 격리

1. 멸균 환경에서 실온으로 유지되는 임상 등급 탁상용 원심분리 기계에 원심분리 튜브를 놓고 100 x g의 속도로 초기 소프트 스핀을 실행합니다. 15 분 동안. 항응고된 혈액은 세 개의 층, 즉 아래쪽의 적혈구, 위쪽의 혈장, 중간의 담황색 피막으로 분리됩니다.

2. 18G 멸균 척추 바늘을 사용하여 멸균 방식으로 삼중 샘플의 최상층을 피펫팅하고 별도의 원추형 바닥 원심분리 튜브에 수집합니다. 수집된 혈장 10mL마다 개별 튜브를 확보하십시오.
   참고: 담황색 털을 포함하기로 한 결정은 우리가 분리하려고 하는 혈소판이 풍부한 혈장의 특성에 달려 있으며, 이는 다시 임상 적용의 특성에 달려 있습니다. 백혈구가 부족한 PRP가 원하는 제품인 경우 버피 코트층을 포함하지 않는 반면, 백혈구가 풍부한 PRP가 원하는 제품인 경우 버피 코트와 함께 상단 혈장층을 피펫으로 분리하여 두 번째 원심분리를 수행합니다.

3. 각각 10mL의 플라즈마가 있는 15mL 원심분리 튜브에서 수집된 혈장을 1600 x g에서 20분 동안 하드 스핀 원심분리합니다. 혈소판은 시험관 바닥의 혈장 펠릿에 존재합니다. 상층액을 별도의 튜브에 모으십시오.

4. 18G 멸균 척추 바늘을 사용하여 혈소판 펠릿을 5mL 주사기에 피펫으로 넣습니다. 펠릿이 있는 모든 시험관을 단일 5mL 주사기에 모아 적용합니다.

5. 두 번째 원심분리 후 원심분리 튜브의 상등액 혈장과 함께 임상용으로 사용할 수 있는 충분한 부피로 수집된 펠릿을 재구성합니다.

3. validation

1. 다음 공식을 사용하여 프로토콜의 혈소판 수를 계산하고 PRP의 절대 혈소판 수, 기준선을 초과하여 달성된 혈소판 농도 구배 및 프로토콜의 혈소판 회수 효능을 계산하기 위해 임상 등급 혈구계를 사용하여 세포 계수를 준비했습니다.
   절대 혈소판 수 = PRP의 혈소판 수(μL) x 1000 x PRP 부피(mL)
   혈소판 농도 구배 =
   혈소판 회수 효율 = <
   span style="color:black; " >예를 들어, PRP 준비에는 기준 혈소판 수가 200,000/μL인 혈액 100mL를 사용하고 최종 혈소판 수가 3,000,000/μL인 PRP 5mL를 얻습니다. 위에서 언급한 매개변수는 다음과 같이 계산됩니다.
   절대 혈소판 수 = 3,000,000 x 1000 x 5 = 150억 혈소판
   혈소판 농도 구배 = 3,000,000 / 200,000 = 15
   혈소판 회수 효율 = 3,000,000 x 1000 x 5 / 200,000 x 1000 x 100 = 75%

2. 반복 사이클을 통해 프로토콜의 복구 효율성을 보장합니다. 효과적인 프로토콜이 활용되면 기준선의 5배 이상의 농도 구배와 >80%의 회수 효율을 제공합니다. PRP 부피의 원하는 사용량에 따라 전달해야 하는 혈소판 수를 그에 따라 적정할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항응고제 구연산염 포도당 용액 IP	Fresenius Kabi, 인도	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke Needle	Becton Dickinson, Spain	405125	18G
DISPOVAN 50ml 주사기	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, 인도
DISPOVAN 5ml 주사기	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, 인도
Spinwin Tube 원뿔형 바닥	Tarsons, 인도	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., USA	XN 350
테이블 탑 임상 원심분리 기계	REMI, 인도	R-8C	4x4 웰 스윙 아웃 로터