동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 형광 마커로 표지된 외인성 응고의 준비(그림 1)
- 30% 산소(1.5L/min, 100% 산소)와 혼합된 3% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다. 근육 긴장도를 관찰하고 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 보장합니다.
- 동물을 멸균 드레이프에 엎드린 자세로 눕히고 흡입 마스크와 30% 산소와 혼합된 2% 이소플루란을 사용하여 마취 상태를 유지합니다. 무균 기술과 멸균 가운/마스크/장갑/기구를 사용하여 다음 절차를 수행하십시오. 절차 전후에 70% 알코올로 실험 영역을 청소하고 소독하여 멸균 상태를 유지하십시오.
- 심장 천자 후 약 300 ~ 1,000 μl의 동맥혈을 채취합니다. 70 μl 전혈을 30 μl C15 프로브(20 μmol/L 농도), 활성화된 인자 XIII(FXIIIa) 응고 효소의 피브린 가교 활성에 민감한 Cy5.5 형광 프로브와 혼합하여 응고를 형광으로 표시합니다(그림 1A). 3ml 주사기(23게이지 바늘)를 사용하여 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브(PE-50, ID 0.58mm)에 혼합된 혈액을 주입합니다. PE 튜브는 멸균(또는 제조업체에서 멸균 인증)해야 하며, 혈전은 조직 배양 후드에서 무균 상태로 준비되어야 합니다.
- 호흡 부족과 심장 맥박의 부족을 관찰하여 동물의 죽음을 확인합니다.
- 혈액이 적재된 튜브를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 4°C에서 22시간 동안 방치하고 이전에 보고된 대로 다음 절차를 수행합니다.
- 혈전이 함유된 튜브를 1.5cm 길이로 자릅니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 3ml 주사기를 사용하여 각 튜브 조각에 PBS를 부드럽게 주입하여 PBS가 함유된 6웰 플레이트로 혈전을 배출합니다. PBS로 혈전을 세 번 세척합니다(그림 1B).
- 15cm 길이의 PE-10 튜브(내경 0.28mm)의 말단 부분에 1.5cm 길이의 혈전을 삽입하고, 튜브의 근위부 끝에 삽입된 30게이지 바늘이 있는 식염수가 채워진 1ml 주사기를 사용하여 기포를 피하면서 세척된 혈전을 조심스럽게 당겨 로드합니다.
- 혈전이 장착된 PE-10 튜브를 끝이 가늘어지도록 수정된 3cm 길이의 PE-50 튜브(I.D. 0.58mm)를 연결하고, 이 튜브는 색전성 뇌졸중의 마우스 모델에서 내부 경동맥(ICA)의 중대뇌동맥(MCA) – 전대뇌동맥(ACA) 분기 영역에 배치됩니다(그림 1C).
2. 혈전색전성 뇌졸중의 마우스 모델 모델링(그림 2)
- 30% 산소(1.5L/min)와 혼합된 3% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 스트로크할 다른 마우스를 마취합니다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 멜록시캠(5mg/kg)을 피하주사합니다. 근육 긴장도를 관찰하고 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 보장합니다.
- 마취 중 건조를 방지하기 위해 각 눈에 소량의 동물용 연고를 바르십시오. 무균 기술과 멸균 가운/마스크/장갑/기구를 사용하여 다음 수술 절차를 수행합니다. 수술 전, 수술 중, 수술 후에 70% 알코올로 수술 부위를 청소하고 소독하여 멸균 상태를 유지하십시오.
- 마우스를 수술대로 이동합니다. 동물을 멸균 드레이프에 엎드린 자세로 눕히고 흡입 마스크와 2% 이소플루란을 사용하여 마취 상태를 유지합니다. 그런 다음 직장 온도계의 피드백과 함께 항상열 담요를 사용하여 체온을 36.5°C로 고정합니다.
- 베타딘과 알코올 70%를 투여한 후 메스를 사용하여 왼쪽 귀와 눈 사이의 두피를 1cm 수직 절개합니다. 레이저 도플러 유량계의 광섬유의 말단부를 노출된 왼쪽 측두골 표면(브레그마 아래 1mm, 아래 4mm)에 붙입니다. 그런 다음 도플러 유량 모니터링을 시작합니다(그림 2A).
- 동물을 눕힙니다. 앞니 윗부분을 핀에 달린 끈으로 당겨 목덜미를 곧게 펴고, 목 부분을 면도합니다. 그런 다음 3cm의 수직 정중선 절개를 만들어 벌리고 혈관 주위 연조직을 절개하여 왼쪽 경동맥 구근 영역을 노출시킵니다. 미주신경을 손상시키지 않도록 주의합시다.
- 멸균 6-0 흑실크 봉합사를 사용하여 좌측 근위 총경동맥(CCA)을 결찰하고, 멸균 7-0 흑실크 봉합사를 사용하여 좌측 ICA와 좌측 익상구개동맥(PPA)을 결찰합니다.
- 좌측 외경동맥의 한 가지인 좌상갑상동맥을 단극성 전기소작기를 이용하여 소작하고, 좌측 근위 외경동맥(ECA)을 느슨하게 결찰하고 원위부 부위는 멸균 7-0 흑색 실크 봉합사를 이용하여 단단히 결찰한다.
- 마이크로 가위를 사용하여 ECA의 결찰 부위 사이에 작은 구멍(직경 약 0.2 ~ 0.25μm)을 만듭니다.
- 혈전이 함유된 카테터를 ECA의 구멍에 삽입하면서 근위 ECA 결찰을 느슨하게 합니다. 카테터를 CCA로 전진시킨 후 근위 ECA 결찰을 다시 조여 카테터를 제자리에 고정합니다.
- 소작하여 원위 결찰 부위의 원위부에 있는 ECA 원위부를 절단하고, CCA에서 카테터를 빼내면서 자유 근위 ECA를 시계 방향으로 회전시켜 ICA 방향에 맞춥니다. 그런 다음 ICA 결찰을 느슨하게 한 직후 카테터를 원위 ICA의 MCA-ACA 분기 영역으로 약 9mm 전진시킵니다. 그런 다음 ICA 결찰을 조입니다.
- 주사기 1ml를 부드럽게 눌러 혈전을 주입하여 혈전을 분기 영역에 놓습니다. 혈전이 혈관을 성공적으로 폐색한 경우 기준선에 비해 30% 이하로 낮춰야 하는 도플러 대뇌혈류(CBF)의 감소를 확인합니다(그림 2B).
- 카테터를 제거하고 ECA 근위 부위를 즉시 단단히 접합합니다. 또한 CCA 및 PPA를 해제합니다.
- 6-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 필요한 시간 동안 도플러 모니터링을 계속한 후 마취를 중지합니다(여기서는 혈전 주사 후 30분 동안). 마우스를 빈 케이지에 넣고 난방 램프로 따뜻하게 유지하십시오. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 얻을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
3. 대뇌 혈전의 생체 내 MicroCT 이미징(그림 3)
대뇌동맥의
- 혈전 배치로 인한 색전 뇌졸중 발병 후 사전 지정된 시점(여기서는 1시간)에 2.1단계에서 설명한 대로 마우스를 2% 이소플루란으로 재마취합니다. 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 보장합니다. 마취 중 건조를 방지하기 위해 각 눈에 소량의 동물용 연고를 바르십시오.
- 10mM PBS에서 10mg Au/ml의 농도로 피브린 표적 금 나노입자(fib-GC-AuNP4)를 재현탁하고 나노 입자의 용해 및 분산을 보장하기 위해 혈전 이미징 에이전트를 30분 동안 초음파 처리합니다. 음경 정맥에 300μl fib-GC-AuNP(10mg/ml)를 주입합니다.
- 동물을 microCT 기계의 침대에 눕히고 핀에 연결된 끈으로 위쪽 앞니를 당겨 목을 곧게 펴서 모션 아티팩트를 줄입니다.
- fib-GC-AuNP 주입 후 5분에 뇌의 마이크로 CT 이미지를 얻기 시작합니다. 여기에 설명된 실험의 경우 다음 이미징 매개변수를 사용합니다: 65kVp, 60μA, 26.7 x 26.7 x 27.9mm3 시야, 0.053 x 0.053 x 0.054mm3 복셀 크기, 프레임당 100밀리초, 1개 평균, 360 보기, 512 x 512 재구성 매트릭스, 600 슬라이스, 64초 스캔 시간.
- 마우스를 빈 케이지에 다시 넣고 난방 램프로 따뜻하게 유지하십시오. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 얻을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
- 마이크로 CT 스캐너에 설치된 소프트웨어 패키지에서 '재구성(Reconstruction)' 패널의 '시작' 명령을 사용하여 원시 이미지 데이터를 DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine) 형식으로 변환합니다.
- 이미지의 정량적 분석을 위해(6단계에서) 제조업체의 지침에 따라 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 DICOM 데이터를 TIFF 형식으로 변환합니다.
- 더 간단하고 빠른 방법으로 정성적 분석과 정량 분석을 수행하려면 소프트웨어 패키지와 DICOM 형식의 원본 0.054mm 두께 이미지를 사용하여 다음과 같이 1mm 또는 2mm(여기서는 2mm) 두께로 렌더링된 새로운 축 및 코로나 이미지 세트를 생성합니다.
- 데이터 소스' 트리에서 DICOM 폴더를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 폴더를 'MasterDB' 또는 'PrivateDB'로 가져옵니다.
- '데이터 소스' 트리에서 'MasterDB' 또는 'PrivateDB'를 클릭하고 가져온 폴더를 선택합니다. 가장 왼쪽 패널의 '3D' 탭을 클릭한 후 '로딩 옵션' 창이 나타나면 '확인'을 눌러 폴더에 있는 일련의 이미지를 스택으로 가져옵니다.
- 축 및 코로나 이미지 창에서 'MRP'라는 단어를 클릭하고 팝업 메뉴에서 'MIP'를 선택하여 이미지 표현을 최대 강도 투영(MIP) 형식으로 변경합니다. 그런 다음 같은 창에서 'TH : 0 [mm]'를 클릭한 후 이미지 두께를 2mm로 변경합니다.
- 이미지 스택을 탐색하고 적절한 각도와 위치에서 슬라이싱할 수 있는 2mm 너비의 3D 내비게이터 바를 사용하여 혈전이 있는 COW(circle of Willis)를 완전히 커버하는 2mm 두께의 축 단면 이미지를 준비합니다. 'Output' 패널에서 캡처 버튼(카메라 아이콘)을 클릭합니다. 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.
- 그런 다음 전두엽에서 소뇌까지 연속적으로 덮인 2mm 두께의 관상동맥 단면 이미지 5개를 준비합니다.
- 먼저, 관상 이미지가 MCA-ACA 혈전을 가장 잘 시각화할 수 있도록 축 이미지에서 내비게이터 바를 조심스럽게 정렬하여 두 번째 슬라이스를 준비합니다.
다음으로 다른 네 조각을 연속적으로 준비합니다. 'Output' 패널에서 캡처 버튼(카메라 아이콘)을 클릭합니다. 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.
