깨어 있는 쥐의 신경 활동을 정확하게 매핑하기 위한 Juxtacellular Recording and Staining

초록

출처: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-Arrest Rats(경보, 머리 구속 쥐의 피질하 뇌 구조 내 단일 뉴런의 모니터링 및 국소화). J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 구속되고 깨어 있는 쥐의 병치세포 기록 및 염색 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런의 신호를 기록하고 염료를 주입하여 기록 부위의 위치를 정확하게 파악하는 작업이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 신경 활동을 뇌의 해부학적 구조에 정확하게 매핑할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 신경 세포 단위의 병치세포 모니터링

1. 팁 직경이 1μm 미만인 이산화탄소 레이저 마이크로피펫 풀러(재료 섹션 참조)에서 석영 모세관 튜브를 당깁니다(그림 2A).
   참고: 가열 매개변수는 특정 기구에 따라 다르며, 필요한 목 직경은 관심 있는 뇌 구조에 따라 다릅니다. 쥐 시상(rat thalamus)에 기록하기 위해 마이크로피펫의 목은 5-7mm입니다.
2. 긴 작동 거리 대물렌즈가 장착된 미분 간섭 대비(DIC) 현미경 아래에 피펫을 제자리에 고정합니다. 모델링 점토를 사용하여 피펫을 현미경의 스테이지에 고정합니다.
3. 피펫 팁을 사용하여 유리 블록(0.5 - 1cm 두께, 초초소형 칼을 만드는 데 사용되는 유리 조각이 편리함)을 시야로 천천히 이동합니다. 스테이지 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 유리잔에 부드럽게 터치하여 유리가 깨지게 합니다. 피펫 팁 외경이 1-3 μm(그림 2B, C) 사이가 될 때까지 필요에 따라 반복합니다. 이러한 마이크로피펫의 임피던스가 약 5-15MΩ 사이인지 확인하십시오.
4. 세포외 식염수(135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), pH 7.2, NaOH)를 준비하고 2%(w/v) Chicago Sky Blue를 추가합니다. 30G 이하의 바늘이 있는 주사기를 사용하여 피펫의 뒤쪽 끝을 용액으로 채웁니다. 또는 단일 세포 병치세포 라벨링의 경우 Chicago Sky Blue 대신 식염수에 2%(w/v) Neurobiotin 또는 biotinylated dextran amine(BDA-3000 또는 BDA-10000)을 추가합니다.
5. 쥐를 단단한 튜브 안의 천 양말 안에 넣고 적절한 실험용 지그 (그림 1)를 사용합니다. 동물을 머리 지지대 지그에 올려 놓기 전에 수술 후 최소 72시간을 기다리십시오. 기도가 막히지 않도록 목이 아닌 흉골 위쪽 주위의 졸라매는 끈을 조입니다. 호흡이 힘들어하거나 방해받는 것 같으면 졸라매는 끈을 풀거나 뒤로 움직입니다. 쥐가 경계하는 동안 이 절차를 수행하십시오.
6. 쥐의 머리 고정 플레이트를 지그의 해당 조각에 부착합니다. 이렇게하려면 먼저 머리 고정 플레이트를 제자리에 고정 한 다음 4-40 나사를 사용하여 고정합니다. 머리에 과도한 토크를 가하지 않도록 동물이 진정될 때까지 기다려야 합니다. 다음으로, 쥐에 이식된 머리 고정 볼트에 8-32 너트를 놓습니다. 그런 다음 나사산이 있는 스테인리스 스틸 막대를 헤드 볼트에 나사로 조입니다. 제자리에 조일 수 있는 방식으로 로드를 실험용 지그에 부착합니다(그림 1).
   참고: 머리 고정 플레이트뿐만 아니라 머리 볼트로 동물을 고정하면 장치의 굽힘을 최소화하고 기록 안정성을 향상시킵니다. 대부분의 경우, 기록은 동물이 머리에 구속된 첫날부터 시작할 수 있습니다. 그러나 동물이 과도하게 꼼지락거리거나 소리를 내는 경우 녹음을 시작하기 전에 하루 동안 머리 억제 습관화 훈련을 제공하십시오. 이 경우 동물을 지그에 15분 동안 그대로 두었다가 다시 우리에 넣으십시오. 다음 날 이 단계를 반복하고 프로토콜을 계속 진행합니다.
7. 기록 챔버를 열고 실리콘 젤을 제거합니다. 개두술에서 조직이 다시 자라면 가는 집게를 사용하여 청소하십시오.
8. 피펫을 전동 micromanipulator에 부착하고 headstage 프리앰프를 연결합니다.
   참고: 본 데모에서는 헤드 스테이지의 작은 릴레이 회로가 증폭기 리드선과 높은 컴플라이언스를 가진 외부 전류 소스 사이를 전환합니다(그림 3A-C). 일부 증폭기에는 적절한 고준수 소스가 내장되어 있습니다.
9. 전동식 micromanipulator를 사용하여 피펫 끝을 기록 챔버의 입체택으로 식별된 표시로 이동합니다. 이 위치의 좌표를 기록해 둡니다. 두개골에 있는 피펫 끝이 부러지지 않도록 주의하십시오.
10. 피펫을 전방-후방 및 내측 축의 원하는 기록 위치로 이동합니다. 그런 다음 약 500μm의 등쪽이 의도한 기록 위치까지 경막을 통해 피펫을 복부로 전진시킵니다.
11. 피펫 팁과 기준 와이어 사이에 기록된 증폭된 전압의 오디오 모니터에서 스파이크 이벤트를 들으면서 피펫을 천천히 전진시킵니다. 스파이크 이벤트가 식별되면 약 500μV보다 큰 양의 전압 편향이 관찰될 때까지 파이펫을 0-100μm로 계속 이동합니다.
    참고: 이 경우 전극 저항은 약 1.5-10배 증가합니다.
12. 기록은 장치가 격리된 후 다른 모든 관심 있는 행동 및 생리학적 측정과 함께 시작해야 합니다. 본 시연에서는 자체 생성된 비브리사 움직임을 고속 비디오 촬영으로 모니터링합니다(재료 섹션 참조).
13. 기록 사이트에 레이블을 지정하려면 전극 리드를 전류 소스에 연결하도록 전환하십시오. 릴레이 회로(그림 3A-C), 증폭기에 내장된 전류 소스를 사용하거나 수동으로(그림 3D) 이를 수행하는 여러 가지 방법이 있습니다. 50% 듀티 사이클에서 4분 동안 2초 펄스로 -4μA를 통과시켜 파이펫을 통해 Chicago Sky Blue를 이온 영동으로 주입합니다.
14. 표준 관행에 따라 여러 라벨링 절차를 거친 후 동물을 죽이고 관류합니다. 뇌를 절편하고 필요에 따라 대조염색하여 기록 부위의 해부학적 위치를 확인합니다. 사이토크롬 산화효소 반응성을 위해 조직을 대조염색합니다. 또는 형광 현미경을 사용하여 Chicago Sky Blue 광상을 식별합니다.
    참고: 서로 다른 라벨이 부착된 단위를 정확하게 구별하려면 라벨 사이에 피펫을 고정하지 않고 같은 날에 동일한 피펫으로 모든 라벨을 만드는 것이 중요합니다. 이 경우, 기록 부위는 사후 조직학에서의 상대적 위치와 각 부위의 언급된 조작자 좌표에 의해 구별될 수 있습니다. 명확한 식별을 위해 라벨을 서로 최소 200μm 간격으로 표시하고 뇌 영역당 3-5개 이하의 라벨을 표시하십시오.

결과

그림 1: 실험용 지그. 전기 생리학 및 행동 모니터링 실험을 위한 기계 지그에 있는 쥐의 다이어그램. 지그는 바와 플레이트

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
그립 시멘트 분말	Dentsply Intl	675571	기록 챔버 바닥
용 그립 시멘트 액체	Dentsply Intl	675572	기록 챔버 바닥 용
실리콘 젤	Dow Corning	Mar-80
제트 틀니 수리 아크릴 파우더	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	머리 지지대를 두개골에 고정하기 위해
Ortho-Jet 빠른 경화 교정 아크릴 수지 액체	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	두개골에 헤드레스트 장치를 고정하기 위해
시카고 스카이	시그마	C8679
파라포름알데히드	시그마	158127	관류 및 조직 고정용
인산염 완충 식염수	시그마	P3813	관류 및 조직 고정용
사이토크롬 C	시그마	C2506
디아미노벤지딘	시그마	D5905
쥐 양말	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A
PVC 튜브 2 1/2"	U.S. Plastic Co.	34108
초소형 D 핀 & 소켓	TE Connectivity	205089-1
스테인레스 스틸 음악 와이어 0.010" 지름	Precision Brand Products, Inc.	21010
입체 고정 프레임	Kopf Instruments	모델 900
입체 이어 바	Kopf Instruments	모델 957
입체 매니퓰레이터	Kopf Instruments	모델 960
1/2mm 드릴 버	Henry	Schein 100-3995
저소음 공기 치과 드릴	중서부 치과	393-1600
스테인레스 스틸 0-80 1/8" 나사	패스너 슈퍼마켓	247438
0.2mL 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-407-8A
맞춤형 헤드 홀딩 바	UCSD SIO Machine Shop	N/A
직각 포스트 클램프	Newport	MCA-1
8-32 3/4" 스크류	패스너 Superstore	240181
4-40 1/4 "스크류	패스너 Superstore	239958
석영 모세관 튜브	셔터 기기	QF-100-60-10
전동 미세 조작기	셔터 기기	MP-285
미세 전극 증폭기	분자 장치	멀티 클램프 700B	대체 부품: 분자 장치 Axoclamp 900A
미세 전극 증폭기 헤드 스테이지	분자 장치	CV-7B	대체 부품: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
절연 펄스 자극기	A-M 시스템	모델 2100	대체 부품: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
오디오 모니터	라디오 판잣집	32-2040
전극 리드선	Cooner 와이어	NEF34-1646
증폭기 헤드 스테이지 용 릴레이	COTO Technology	# 2342-05-000	(옵션) 맞춤형 인쇄 회로 기판 (UCSD Physics Electronics Shop)과 함께 사용, 그림 6A-C
디지털 비디오 카메라	Basler	A602fm
피펫 홀더	Warner Instruments	#MEW-F10T
사용자 정의 헤드 홀딩 플레이트	UCSD SIO 기계 공장	N / A

블루