마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

초록

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미세주입

1. : 정위 기구를 70% 에탄올로 철저히 닦아 멸균 수술을 준비합니다. 수술 기구를 70% 에탄올에 담가 멸균합니다.
2. 70% 에탄올로 강아지의 머리를 문지릅니다. 두개골에서 랜드마크 람다를 찾아 마커 펜으로 람다를 표시합니다. 바늘 끝을 람다에 대고 전후방(AP) 및 내측-외측(ML) 좌표를 0으로 설정합니다.
3. 사출 암을 대상 부위의 X 및 Y 좌표에 따라 대상 부위로 이동합니다. 출생 후 날(P) 2마리의 선조체의 경우 좌표는 다음과 같습니다: AP, 람다 앞쪽 +2.4mm; ML, 정중선에서 ±1.0mm 측면; 등쪽-복부(DV), 두개골에서 -1.7mm. 펜으로 PE10 튜브에 빠른 녹색 염료의 위치를 표시합니다.
4. 30G 주사 바늘을 천천히 내려 피부와 두개골을 관통한 다음 바늘 끝이 두개골 표면에서 멈출 때까지 들어 올립니다. DV 좌표를 0으로 설정합니다.
5. 30G 주사 바늘이 대상 부위의 DV 좌표에 도달할 때까지 천천히 내립니다. 실질이 정상적인 모양으로 돌아올 때까지 1분 동안 기다리십시오. 그런 다음 마이크로 주입 프로그램(100nL/min)을 실행합니다.
6. 바이러스 액체가 뇌에 주입되도록 PE 튜브에서 빠른 녹색 염료 표시가 움직이고 있는지 확인하십시오.
7. 미세 주사 종료 후 1분 동안 기다린 다음 30초 이내에 바늘을 DV 깊이의 1/2 높이까지 천천히 점진적으로 들어 올립니다. 30초 후 강아지의 머리에서 천천히 바늘을 빼냅니다.

2. 강아지의 수술 후 회복

1. 강아지를 33°C 인큐베이터에서 20분 동안 예열합니다. 강아지가 흉골 누운 자세를 유지할 수 있는 충분한 의식을 회복할 때까지 5분마다 저체온 마취에서 강아지의 회복을 확인하십시오.
2. 강아지가 완전히 회복된 후 강아지를 댐으로 돌려보내십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Hamilton MICROLITER 주사기	Hamilton	80300	PE10 튜브에 맞는 30G 바늘; 26G 바늘에는 PE20 어댑터
폴리에틸렌 튜브 PE20	이 필요합니다.Becton Dickinson	427406
폴리에틸렌 튜브 PE10	Becton Dickinson	427401
마이크로 유량 주사기 펌프	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A(컨트롤러) 및 L0107-2A(구동 장치)
25G 주사기	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.10%
표준 정위 기기	RWD 생명 과학	68037	68030 마우스/신생아 쥐 어댑터
LSM 880 공초점 현미경	Zeiss	LSM 880
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn 벡터 코어	AV-9-PV1848	로트 # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
B6. CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	잭슨 연구실	7914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2TM1.1SFIS/CFREJ	슨 연구실	26259	Foxp2FL/FL

잭