미생물 planktonic 커뮤니티에서 신진 대사 추출을위한 방법을 설명하고있다. 전체 지역 사회의 샘플링 특별히 준비 필터로 여과에 의해 이루어진다. lyophilization 후 수성 - 용해 metabolites가 추출됩니다. 이 접근법은 자연이나 실험적인 미생물 커뮤니티의 횡단 omics 조사에 환경 metabolomics의 적용을 허용합니다.
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방법 논문
핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
환경 metabolomics는 유기체가 반응 및 생화 학적 수준 1의 환경과 서로 상호 작용하는 방법에 새로운 이해를 추진하고 신흥 분야이다. 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 공부에 대한 상당한 약속과 함께, 가스 크로마 토그래피 - 질량 분석계 (GC-MS) 등 여러 기술 중 하나입니다. NMR의 장점은, 타겟이 분명하지 않은 분석에 적합한 구조 정보를 제공하며 스펙트럼은 각각의 신진 대사 스펙트럼 2,3 최근에 사용 가능한 데이터베이스에 대한 양적 및 통계 매너에 쿼리할 수 있습니다. 또한, NMR 분광 데이터는 서로 taxa의 생리적 반응과 환경 4,5,6의보다 포괄적인 이해를 제공하기 위해 다른 omics 수준 (예 : transcriptomics, 유전체학)의 데이터와 조합하여 사용할 수 있습니다. 그러나 NMR은 어려운에게주고, 다른 metabolomic 기법 미만 구분 AP샘플 인구가 낮은 잘 정의와 같은 전체 조직, biofluids 또는 셀 - 문화 등 쉽게 추출물 소스.에서 metabolites에 비해 낮은 밀도와 신진 대사 농도가 될 수있는 천연 미생물 시스템에 플라이 따라서 날짜에 수행된 미생물의 몇 가지 직접적인 환경 metabolomic 연구는 이러한 호스트 symbiont 시스템과 같은 문화 기반 또는 쉽게 정의 고밀도 생태계, 안정 동위 원소 라벨이 될 수 직감 환경의 공동 문화 또는 조작 구축으로 제한되었습니다 또한 NMR 신호에게 7,8,9,10,11,12을 향상시키기 위해 사용됩니다. NMR에 적합한 농도로 환경 metabolites의 농도와 컬렉션을 촉진 방법은 부족합니다. 최근 관심이 많은 에너지와 물질의 흐름은 planktonic 커뮤니티 13,14에 의해 매개되는 수생 환경 내에서 생물의 환경 metabolomics 부여 되었기 때문에, 우리는 집중하는 방법을 개발했습니다기 및 여과에 의한 planktonic의 미생물 시스템과 전체 - 커뮤니티 metabolites의 추출. 상용 친수성 폴리-1 ,1-difluoroethene (PVDF) 필터는 특별히 완전히 달리 후속 분석에서 오염 물질이 나타날 수 extractables를 제거하는 처리됩니다. 이러한 처리 필터는 다음 관심있는 환경 또는 실험용 샘플을 필터링하는 데 사용됩니다. 젖은 샘플 자료가있는 필터는 동결 건조된이며 수성 - 용해 metabolites는 표준화된 칼륨 인산 추출 버퍼 2를 사용하여 기존의 NMR 분광법에 대해 직접적으로 압축이 풀립니다. 이러한 방법에서 파생된 데이터는 통계적으로 의미있는 패턴을 식별하는 분석, 또는 지역 사회와 생태계 기능의 포괄적인 이해를위한 다른 omics 수준과 통합 할 수 있습니다.
프로토콜
1. Extractables를 제거하는 필터 준비
- 25-mm 직경 0.22 μm의 기공 크기 Durapore PVDF 친수성 필터 (Millipore)를 사용합니다. 깨끗한 500 ML Pyrex의 비커에 장소 필터 핀셋을 사용합니다. 증류수로 세 번 사전 린스. 당신은 서로 고집에서 필터를 방지하기 위해 린스로서 소용돌이. 300 ML 밀리 Q (Millipore) 또는 이에 상응하는 양질의 물을 추가합니다. 필터에서 extractables의 완전한 제거를 용이하게하기 위해 압력솥.
- 밀리 Q를 붓고 다시 트리플 밀리 Q와 함께, 이번에는 필터를 린스. 깨끗하고 건조한 표면 (예 : 알루미늄 호일 같은)과 합당한 온도 (예, 37는 ° C) 또는 공기 건조시 건조 중의 족집게 장소 개별 필터를 사용합니다. 필터를 사용할 수 있습니다.
2. 샘플 재질의 여과
- 유리가 지원과 함께 25 mm microanalysis 필터 컬럼으로이 프로토콜, Millipore 스테인리스 3 곳 필터 매니폴드를 입증할그리고 기계식 펌프가 사용됩니다. 무균 기술을 사용하여 필터를 열베이스에 단일 25-mm 필터를 추가, 컬럼을 적용하고 함께 클램프.
- , 컬럼에 시료의 15....
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토론
여기서 보여준 여과 및 신진 대사 추출 방법은 NMR의 metabolomics에 충분한 금액을 회수하기 위해 미생물 planktonic의 바이오 매스를 얻을 수 있습니다. KPI 및 1D 1 H NMR을 사용하여 수성 - 용해 metabolites만을 추출을 시연하는 동안 다른 추출 용매와 spectroscopic 방법을 사용할 수 있습니다. 하나의 유용한 예제는 이기종 샘플에서 우수한 NMR의 스펙트럼을 생산하기 위해 그림과 상자 성체의 이온에 의한 오염에 덜 민감로서 해양 시료 15 발견되었습니다 세미 극지 용매와 같은 진정제를 맞았을 메탄올의 사용이다. 이런 경우에는 위의 추출의 펠렛은 연속 extractions 보관하여야한다. 우리의 이전 작업은 배양 시간 및 온도와 NMR 분광법 15-20에 대한 직접적인 수성 추출의 적합성 아래 스펙트럼의 안정성을 보이지 않고있다. 그러나 연구자는 또한 dena를 사용하여 예를 들어, 추출 단계를 수정하는 것이 좋습니다이전 .......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
본 연구에 의해 부분적으로 지원되었다 보조금-원조 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부에서 답사의 연구 (JK) 및 학술 연구 (A) (JK 및 SM)에 도전을위한 과학 연구, 기술, 일본 . RIKEN FPR 교제 (경찰과)이 추가 지원을 제공했습니다. 저자는 Drs들에게 감사드립니다. Eisuke Chikayama, NMR 및 통계 분석과 기술 지원을 Yasuyo Sekiyama와 마미 오카모토.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 0.22 μm의 친수성 PVDF Durapore 필터, 25mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis 필터 홀더, 25mm가 유리를 지원 fritted | Millipore | XX1002500 | |
| 3 - 장소 매니폴드, 47mm, 스테인레스 스틸 | Millipore | XX2504735 | |
| KH 2 PO 4 | 와코 | 169-04245 | |
| K 2 HPO 4 | 와코 | 164-04295 | |
| 중수소 산화, 2 H> 90% | Campridge 동위 원소 Laboratoties | DLM-4 | > |
| DSS | Fluka | 92,754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | 스테인레스 스틸 crushers 포함 |
| Thermomixer 편안함 | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| 진공 증발기 | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | 5mm-TXI 프로브와 DRX-500 | |
| 스펙트럼 binning 도구 | 원래 개발 | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| 신진 대사 주석 도구 및 데이터베이스 | 원래 개발 | SpinAssign | = nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
참고문헌
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a si....
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재인쇄 및 허가
