동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 기록 주입 피펫 조립
- 피펫 풀러를 사용하여 약 7cm 길이의 유리 모세관(외경 1mm)을 당깁니다.
- 모세관의 끝을 부수고 광학 현미경으로 조리개를 확인하십시오. 내경이 30μm에서 40μm 사이인지 확인합니다.
- 유리 피펫의 가늘어지지 않은 끝에서 약 1cm 돌출된 7cm 길이의 은선을 유리 모세관에 삽입합니다.
- 여분의 필라멘트를 유리 모세관에 직교로 구부립니다.
- 30G 피하 주사 바늘의 샤프트에 유연한 플라스틱 접착제 방울을 도포합니다.
- 그림 1에 제시된 회로도에 따라 유리 피펫에 30G 피하 주사 바늘을 삽입합니다.
- 유리 피펫과 피하 주사 바늘 사이의 접합부에서 적절한 밀봉을 보장하기 위해 접착제의 두 번째 코팅을 추가합니다.
- 접착제가 적절하게 경화되도록 팁이 위쪽을 향하도록 피펫을 약 12시간 동안 건조시킵니다. 완성된 결과는 그림 2에 나와 있습니다.
참고: 이 절차는 급성 실험에서 수행되며 피펫 팁의 멸균이 필요하지 않습니다.
2. 동물 준비
:
- 쥐를 마취 상자에 넣습니다.
- 4% 이소플루란을 사용하여 5-10분 동안 마취를 유도합니다.
- 체온을 37°C로 유지하기 위해 가열 패드와 직장 탐침이 있는 정위 테이블에 동물을 놓습니다. 코콘을 사용하여 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 이어바와 치아 홀더를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다.
- 동공 확장을 돕기 위해 1% 아트로핀 점안액이 포함된 안과 연고나 안약을 바르십시오. 건조함을 방지하려면 약 30분마다 윤활제를 바르십시오.
- 머리를 면도하고 10% 포비돈-요오드로 청소하십시오.
- 국소마취의 경우 2% 리도카인 0.5ml를 피부를 들어 올려 바늘 끝을 삽입하여 두피 아래 2-3개소에 주입합니다.
- 발가락 꼬집기를 수행하고 움직임의 부족을 관찰하여 적절한 수준의 마취를 확인합니다. 또한 심박수를 모니터링하여 정상 값(300-400회/분) 내에 있는지 확인하십시오.
- #10 메스 날로 정중을 따라 두피를 일직선으로 절개하여 관상 봉합사와 시상 봉합사를 모두 노출시킵니다.
- 수술용 주걱으로 두개골을 덮고 있는 조직을 밀어내어 람다와 브레그마 지점을 드러냅니다.
- Bregma와 Lambda 위치가 같은 평면에 있도록 두개골의 수평을 맞
춥니다.- 기준점을 설정하려면 유리관이 장착된 정위 장치를 사용하여 Bregma 바로 위에 설정합니다. 이것은 전후방 및 내측-외측 측정 좌표의 "0"이 됩니다.
- 정위 마운트를 필요한 좌표로 이동하여 관심 지점을 설정하고, 정위 좌표를 기록한 다음 개두술이 수행될 위치를 표시하는 대상 영역 주위에 사각형을 그립니다.
- 멸균된 드릴 비트가 있는 수술용 드릴을 사용하여 표시된 사각형을 따라 압력 없이 천천히 뼈 물질을 제거합니다. 같은 부위에 너무 오래 구멍을 뚫으면 열이 발생하여 피질에 병변이 생기므로 주의하십시오.
- 개두술을 구분하는 뼈가 충분히 얇아지면 핀셋으로 두개골 부분을 조심스럽게 제거하여 피질을 노출시킵니다.
- 조직 건조를 방지하기 위해 노출된 피질을 인공 뇌척수액으로 자주 세척하십시오.
참고: 주사기의 끝이 관통할 수 있을 만큼 튼튼하기 때문에 쥐의 경우 경막 제거가 필요하지 않습니다.
3. 주입 시스템의 충전 및 장착
- 5-10 μl 마이크로 주사기에 미네랄 오일을 흡인하여 채웁니다.
- 0.5% 시카고 스카이 블루(CSB) 및 300μM γ-아미노부티르산(GABA) 용액 또는 0.5% CSB가 포함된 2% 리도카인 용액으로 고정 유리 피펫으로 피하 주사 바늘을 채웁니다. 모든 용액을 식염수로 희석하십시오.
- 물질이 풍부한 경우 일반 주사기를 사용하여 주입하고 기포 형성을 방지하기 위해 일반적인 예방 기술을 사용하십시오.
- 더 비싼 물질의 경우 미네랄 오일을 사용하여 주입 주입기를 채우면 흡인을 통해 화학 약품을 도입할 수 있습니다. 광유와 물의 밀도 차이가 상대적으로 높기 때문에 이 물질은 수용액 주입에 적합한 물질입니다.
참고: 두 액체 사이의 분리를 확인하기 위해 염료를 첨가할 수 있습니다.
- 주사 피펫을 채우려면 흡인하여 1ml 주사기에 용액을 채운 다음 주사 피펫에 용액을 천천히 주입합니다.
- 그림 1에 표시된 영역의 누출에 세심한 주의를 기울여 이 영역을 깨끗하게 닦고 주사기로 용액을 천천히 주입하여 누출을 관찰합니다.
- 1ml 주사기를 제거합니다. 그렇게 할 때 진공이 주입 피펫에서 용액을 제거하지 않도록 플런저에 가벼운 압력을 유지하십시오.
- 흡인하여 마이크로 주사기에 미네랄 오일을 채우고 채워진 주입 피펫에 단단히 부착한 다음 거즈로 조립된 주사기에서 여분의 용액을 조심스럽게 닦아냅니다.
- 유리 피펫 끝에 작은 방울이 형성되는 것을 볼 수 있을 만큼 매우 적은 양을 주입하여 팁이 막히지 않았는지 확인합니다.
- 인젝트로드를 마이크로펌프 시스템에 장착하고 잘 고정되었는지 확인하십시오.
- 주입 팁을 목표 좌표에 조심스럽게 배치하고 팁을 피질 표면으로 내립니다.
- 적절한 해부학적 좌표를 사용하여 정위 장치를 사용하여 주입기를 표적 구조(이 경우 상구)까지 천천히 내립니다.
- 조직 건조를 방지하기 위해 노출된 피질을 따뜻한 한천으로 덮습니다.
4. 주입 및 가역적 비활성화
미
- 세 주입 펌프를 40nl/min으로 400 - 800 nl을 주입하도록 설정하고 실행을 눌러 주입을 시작합니다. 스파이크 속도는 주사 중에 감소를 나타냅니다.
참고: 실험 설정에서 신경 활동은 GABA 전달 종료 후 1시간 이내에 회복되었습니다. 보정된 모든 기계 장치를 사용하여 주입을 수행하기 위해 미세 주입 주사기에 압력을 가할 수 있습니다. - 전기생리학적 데이터를 획득한 후 지역 동물 윤리 위원회에서 승인한 방법을 사용하여 안락사시킵니다.
