유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

초록

출처: Tadokoro, T., et al. 성인 마우스에서 연하 아데노 관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 전달. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 마우스의 척수에 유전자 전달을 위한 연막하 주입 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 경막을 노출시키고, 연막을 천공하고, 형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 연막하 공간에 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 및 회복 후 바이러스는 척수 세포의 유전자 발현을 촉진하여 표적 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 일반 동물 및 수술 준비

1. 수술 절차를 시작하기 전에 바이러스를 해동합니다(AAV9-UBI-GFP [UBI: UBIQUITIN PROMOTER, GFP: GREEN FLUORESCENT PROTEIN]; 5 μL 분취량). 증류수에 덱스트란 분말을 혼합하여 5% 덱스트란(10,000MW) 용액을 준비합니다. 바이러스 용액을 5% 덱스트란 용액과 1:1로 혼합하여 최종 덱스트란 농도를 2.5%로 만듭니다.
   1. 바이러스 용액을 얼음(4°C)에 보관합니다.
2. 성체 C57BL/6J 마우스(수컷 및 암컷, 20-30g)를 사용하십시오. 5% 이소플루란(O₂, 1 L/min)을 사용하여 마우스를 마취하고 호흡수 및 발 꼬집기 반응에 따라 수술 중 코콘에 의해 2-3% 흡입 이소플루란(O₂, 1 L/min)으로 유지합니다.
3. 면도 가위로 동물의 등을 면도하고 2% 클로르헥시딘으로 피부를 깨끗이 닦습니다.
4. 만성 회복 연구에서는 엄격한 멸균 기술을 따르십시오.
5. 요추 연막하 주사를 시행하는 경우 Th8-L1 척추뼈를 덮고 있는 피부를 메스로 절단하고 가위를 사용하여 Th10-12 척추에서 척추주위 근육을 분리합니다.
   1. 마우스 척추 클램프를 사용하여 동물을 표준 정위 프레임에 장착합니다.
   2. 균열이 나타날 때까지 치과용 드릴(드릴 비트: 0.9mm, 속도: 20,000rpm)을 사용하여 Th10-12 척추뼈의 박판 양면을 면도합니다.
   3. 집게로 갈라진 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 등쪽 표면을 노출시킵니다.
   4. 1G 스테인리스 스틸 바늘과 집게를 사용하여 경막을 약 30cm 잘라냅니다.

2. 피어 멤브레인을 열고 AAV9 전달을 위해 피알하 바늘을 삽입

합니다.

1. 유리 모세관 홀더를 사용하여 34G 피아 관통 바늘을 XYZ 매니퓰레이터의 Z-암에 장착합니다(그림 1A 및 B).
   참고: 연막 관통 바늘을 제조하기 위해 34G 바늘의 원래 경사진 팁은 다이아몬드 연마판이 있는 유리 모세관 베벨러를 사용하여 날카롭게 합니다. 크기) 및 15 - 20°의 연삭 각도. 그런 다음 바늘 끝(1mm 길이, 끝에서 측정)을 약 90°로 부드럽게 구부립니다(그림 1B, 왼쪽 삽입).
2. 8-10X 배율로 설정된 외과적 해부 내시경을 사용하여 X-arm을 사용하여 연막 관통 바늘로 연막을 약 1mm(그림 1C)까지 관통합니다.
   관
   1. 통 바늘이 조직 표면에 대한 각도를 5-10°로 유지합니다.
3. 연막을 열은 후 X-arm을 사용하여 연막하 공간(그림 1D)에서 수평으로 연막 관통 바늘을 제거합니다.
   참고: 혈관과 같은 랜드마크에 의해 관통된 부위를 기억하십시오.
4. PE-10 또는 PE-20 튜브로 주사 바늘에 연결된 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 AAV9-UBI-GFP 바이러스가 있는 무딘 36G 주사 바늘을 로드합니다.
5. 유리 모세관 홀더(그림 1B, 오른쪽 삽입물)를 사용하여 바늘을 두 번째 XYZ 조작기(그림 1A 및 B)의 Z-암에 장착합니다.
   참고: 연막하 AAV9 주사 바늘을 제조하기 위해 36G 바늘의 뭉툭한 끝을 다이아몬드 연마판이 있는 유리 모세관 베벨러를 사용하여 연마하여 거친(5.0μm에서 50μm 팁 크기) 날카로운 모서리를 제거합니다. 그런 다음 바늘 끝(길이 2-3mm, 끝에서 측정)을 약 90°로 부드럽게 구부립니다. 연막 관통 및 연막하 주사 바늘을 1-2cm 길이의 20G 슬레이브 스테인리스 스틸 튜브(바늘 끝에서 10mm)에 삽입하고 에폭시로 접착합니다. 유리 모세관 홀더에 안전하게 부착하려면 20G(직경 0.91mm) 튜브를 사용해야 합니다.
6. 제2 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 조작하여 AAV9 주사 바늘의 끝을 연막 관통 부위에 배치한 다음 X-암을 사용하여 이전 연막 개구부를 통해 연막하 공간으로 약 2-3mm 전진시킵니다(그림 1E 및 F).
   참고: 1) AAV9-UBI-GFP는 이전에 보고된 프로토콜에 따라 준비됩니다. 최종 역가는 1.2 x 10 mL당¹³ 게놈 사본(gc/mL)으로 조정됩니다. 2) 연막 개구부는 쉽게 식별할 수 있기 때문에 표시할 필요가 없습니다(그림 1D).
7. 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 AAV9-UBI-GFP(1.5, 3 또는 5 μL)를 연막하 공간에 주입합니다(실험군은 표 1 참조).
8. AAV9-UBI-GFP 주사가 완료된 후 연막하 공간에서 주사 바늘을 제거합니다.
9. 4.0 모노필라멘트 봉합사와 수술용 클립을 사용하여 근육과 피부를 봉합합니다.
   참고: 열린 척추뼈를 밀봉할 필요가 없습니다.
10. 동물이 가열 패드에서 회복되도록 하십시오.
11. 통증 조절을 위해 수술 후 2-3일 동안 12시간마다 부프레노르핀 0.05mg/kg/sc를 주사합니다.

표 1: 실험군. 모든 실험은 성체 C57BL/6J 마우스에서 수행되었습니다.

<그림 class='table'>

실험군	AAV9 전달 부위/수준(*)	AAV9 주사량, 주입 속도	생존 시간	조직 분석
그룹 A(n = 7)	C2(양측)	5 μL/5분	14일	뇌 + 척수
그룹 B(n = 12)	L1-L2(양측)	1.5 μL 또는 3μL, 60초/μL	14일	뇌 + 척수
그룹 C(n = 6)	C2 + L1-L2(각 수준에서 양측)	5 μL/5분	14일	척수
* - 양측 = 2개의 연막하 주사, 하나는 주입된 분절의 오른쪽으로, 다른 하나는 왼쪽 연막하 공간으로 전달됩니다.

결과

그림 1: 성인 마우스에서 척추 연막하 주사를 수행하기 위한 실험적 설정. (A) 성체 마우스에서 척추 연막하 주사를 수행하기 위해 두 개의 개별 XYZ 조작기(I 및 II)가 사용됩니다. (B) 각 매니퓰레이터의 Z-암에는 유리 모세관 홀더가 있습니다. 하나의 모세관 홀더는 연막을 관통하는 34G 바늘을 고정하고 두 번째 홀더는 뭉툭한 3...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	664
실험실 마우스용 표준 정위 고정 하	버드 장치	72-9568
마우스 척추 어댑터	하버드 장치	72-4811
XYZ 매니퓰레이터	Stoelting	51604
수동 주입 펌프	Stoelting	51218
34G 경사진 나노필 바늘	월드 정밀 기기	NF34BV-2
36G 무딘 나노필 바늘	월드 정밀 기기	NF-36BL-2
플루리소, 이소플루란	MWI 수의학 공급	502017
클로르헥시딘 용액	MWI 수의학 공급	501027
20G 스테인리스 스틸 바늘	Becton-Dickinson	305175
23G 스테인리스 스틸 바늘	Becton-Dickinson	305145
30G 스테인리스 스틸 바늘	Becton-Dickinson	305128
면 팁 어플리케이터	MWI 수의학 공급	27426
유리 모세관 베벨러	나리시게 인터내셔널	SM-25B
슬라이드 현미경 슈퍼프로스트	라이카 마이크로시스템	M80
50μl 마이크로시린지	해밀턴	81242
BD 인트라메딕 PE-20 튜빙	벡톤, 디킨슨	427406
BD Intramedic PE-10 튜빙	Becton, Dickinson	427401
4-0 모노필라멘트 봉합사	VetOne	V1D397
유리 모세관 베벨러	Narishige	피펫 마이크로 그라인더 EG-40
5분 에폭시(에폭시 클리어)	Devcon	14310
덱스트란	폴리사이언스, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD 바이러스 벡터 코어 연구소