생체 내 이미징을 위한 마우스의 척수 창 이식

초록

출처: Pietruczyk, E. A., et al. 마우스의 추궁 절제술 및 척수 창 이식. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 척수 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 붕규산 커버 유리와 3D 프린팅 백플레이트를 사용하여 노출된 척수를 안정화합니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 2광자 현미경을 사용하여 혈액-뇌 장벽 역학 및 신경혈관 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 커버 유리 이식

1. : 노출된 코드에 3mm 붕규산 커버 유리를 부드럽게 도포합니다.
2. 아가로스가 39°C로 냉각되었는지 확인합니다. 작은 주걱을 사용하여 따뜻한 2% 아가로스/aCSF(인공 뇌척수액)를 커버 유리 가장자리에 바르고 모세관 작용으로 표면 아래로 끌어당깁니다.
   참고: 39°C 미만의 온도에서는 아가로스가 겔화되기 시작할 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 수조나 전자레인지를 사용하여 다시 데우십시오. 일부 작업자는 먼저 아가로스 한 방울을 바르고 그 위에 커버 유리를 놓는 것을 선호합니다.
3. 흉부 11 수준 척추와 흉부 13 수준 척추에서 온전한 인접 척추의 노출된 뼈 관절 돌기에 조직 접착제를 도포합니다. 추궁 절제술 부위 주변, 인접한 힘줄 및 가로 돌기 위에 링에 추가 조직 접착제를 도포합니다.
   참고: 후속 단계에서 치과용 시멘트에 적절하게 접착하려면 조직 접착제가 필요합니다. 관절 돌기는 백플레이트가 안정적으로 놓일 수 있는 자연스러운 시트를 형성합니다(그림 1). 관절 돌기에 대한 접착은 가장 강력한 부착 지점을 형성합니다.
도
4. 자기 혼합 트레이에 치과용 시멘트와 촉진제를 혼합합니다. 작은 주걱을 사용하여 치과용 시멘트를 조직 접착층에 옮깁니다. 치과용 시멘트를 사용하여 백플레이트를 창 중앙의 수술 부위에 부착합니다. 치과용 시멘트가 경화될 때까지 10분 정도 기다리십시오.
   참고: 백플레이트가 전방 및 후방 관절 돌기에 단단히 접착되어 임플란트의 근본적인 구조적 안정성을 제공합니다.
5. 추가 치과용 시멘트를 사용하여 백플레이트의 내부 베이스와 백플레이트의 밑면을 채우십시오: 조직 인터페이스.
   참고: 치과용 시멘트를 추가로 적용하면 접착력이 향상되고 현미경 대물렌즈 침지 유체(식염수)가 백플레이트 바닥으로 누출될 위험이 줄어듭니다.
6. 갈래 백플레이트 홀더를 창 위의 적절한 위치로 전진시킵니다. 나사로 백플레이트를 백플레이트 홀더에 고정합니다.
   참고: 이 프로토콜은 맞춤형 가공 백플레이트 홀더를 활용했습니다(그림 2G\u2012H).
7. 백플레이트에 식염수를 바르고 누출 여부를 테스트합니다. 체액이 새면 해당 부위를 말리고 치과용 시멘트를 더 바르십시오.

2. 이미징 준비

1. 동물을 수술 플랫폼의 광학 테이블로 옮깁니다.
   참고: 당사의 수술 플랫폼, 백플레이트 홀더 및 이소플루란 노즈콘 홀더는 지속적인 이소플루란 마취를 적용하는 동안 수술용 이미징 스테이션과 2광자 이미징 스테이션 사이를 하나의 장치로 운반할 수 있습니다(그림 2D, H). 유사한 장치는 상업적 소스(예: ThorLabs)에서 얻을 수 있는 포크, 빔 및 지지 기둥 기둥을 고정하여 조립할 수 있습니다. 생체 내 현미경 검사의 경우 수술 플랫폼의 높이를 수용하기 위해 현미경 대물렌즈와 광학 테이블 사이에 최소 11인치의 간격이 있어야 합니다.
2. 스테인리스 스틸 마운팅 포스트와 카운터보어 클램핑 포크를 사용하여 수술 플랫폼을 광학 테이블에 부착합니다.
3. 백플레이트의 우물에 신선한 식염수를 바르십시오. 침수 렌즈를 우물에 내립니다.
4. 투과광 또는 낙산화형광을 사용하여 관심 영역과 초점을 식별합니다. 레이저 스캐닝 모드로 전환하고 조직에 존재하는 형광단에 대한 적절한 2광자 레이저 여기 파장, 이색성 및 대역 통과 필터에 따라 생체 내 이미징을 수행합니다6.

결과

그림 1. 척수 창의 해부학적 배치에 대한 개략적인 묘사. A) 하부 흉추체, 극돌기 및 척수(sc) 분절의 상한 모습에 대한 개략적인 묘사. 점선 원은 백플레이트 접착의 주요 지지점인 관절 돌기의 시트를 나타냅니다. B) 척수 창의 상부 보기에 대한 개략적인 묘사. 대상 척추(여기서는 T12)가 제거되었습니다. 얇은 아가로스 층이 척수를 덮고 있습니다. 커버 유리가 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3D 프린팅 타원형 백플레이트	맞춤형		안정화 이미징 필드
수술용 해부 현미경	Leica	M205 C	Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M 시리즈 대물렌즈 및 글라이딩 스테이지 장착
현미경 카메라	라이카	MC170	수술 부위 시각화를 위한 HD 컬러 카메라
글라이딩 스테이지	라이카	10446301	글라이딩 스테이지는 두 개의 금속판으로 구성됩니다. 베이스 플레이트가 고정되어 있습니다. 상부 플레이트는 그리스 도포 된 인터페이스에서 미끄러져 회전 및 선형 이동을 허용합니다.
수술 스테이션 및 안정화 포크	Whale Manufactoring	맞춤형	추궁 절제술
SomnoSuite 저유량 이소플루란 전달 장치	Kent Scientific	SS-01	통합 디지털 기화기를 사용한 외과적 마취 관리
스테인리스 스틸 1.5인치 마운팅 포스트	ThorLabs	P50/M	2광자 이미징
을 위한 광학 테이블에 수술 스테이션 장착용1.5" 마운팅용 카운터보어 클램핑 포크 포	ThorLabs	PF175	2광자 이미징을 위한 광학 테이블에 수술 스테이션 마운트 안정화용
뼈 마이크로드릴	하버드 장치	72-6065	추궁 절제술을 위한 뼈 얇아짐
수조	피셔 사이언티픽	15-462-10	온난화 식염수
작 건	FST	18010-00	소작 경미한 출혈
가열 패드	벤치마크	BF11222	1.9" x 4.5" 실리콘 히터, 20" 테프론 리드, 10W, 5V
K 유형 열결합 직장 프로브	Physitemp	RET3	마우스 체온 측정
바셀	젤리 시그마	8009-03-08	윤활 직장 프로브
피드백 조절 열 컨트롤러	맞춤형	NA	상업적으로 이용 가능한 대안으로는 Physitemp TCAT 시리즈
PVA 수술용 눈창	Beaver-visitec international	40400-8	흡수 혈액
전기 트리머	Wahl	41590-0438	트리밍 마우스 모피
블레이드, #11	FST	14002-14	수술 도구
겸자, #5	FST	11254-20	수술 도구
겸자, #4	FST	14002-14	수술 도구
티타늄 톱니 겸자	WPI	555047FT	수술 도구
티타늄 홍채 가위	WPI	555562S	수술 도구
Vetbond 조직 접착제	3M	084-1469SB	치과용 아크릴용 조직 표면 준비
혼합 트레이	Jack Richeson	420716	치과용 아크릴 혼합제 촉진제 포함
Orthojet 치과용 아크릴	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	조직에 영구적으로 접착 백플레이트
작은 원형 커버 유리, #1 두께, 3mm	하버드 장치	64-0720	광학 창
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	aCSF
포도당	피셔 사이언티픽	50-99-7	aCSF
HEPES	시그마	7365-45-9	aCSF
MgCl₂·6H₂O	피셔 사이언티픽	7791-18-6	aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	aCSF
카프로펜	리마딜	QM01AE91	진통제
균수	Henry Schein	2587428	카프로펜
소플루란	Henry Schein	11695-6776-2	마취
젖산 링거 용액	Baxter	0338-0117-04	마우스용 수화
Agarose High EEO	Sigma	A9793	겔 포인트 34-37도 C
과 윤활 연고	Akwa Tears	68788-0697	각막 건조 방지
MOM 2광자 현미경	서터

스트 이상적인 소린 세라믹 피셔 사이언티픽 7791-18-6 정 이용 희석제 안