Method Article

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

DOI:

10.3791/3168

⸱

July 9th, 2011

 ,  , 
1Defence Medical and Environmental Research Institute, DSO National Laboratories, 2Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School, 3Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.

Abstract

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바이러스와 세포 사이의 상호 작용의 초기 이벤트는 감염의 결과에 지대한 영향을 가질 수 있습니다. 이 상호 작용에 영향을 미치는 요인을 결정하는 것은 질병 pathogenesis 개선 이해로 이어질 때문에 예방이나 치료 설계에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서,이 상호 작용을 조사하는 방법의 개발이 유용할 것입니다. fluorophores 개발 1-3 및 이미징 기술 4 최근 발전은 뎅그열 pathogenesis에 대한 현재의 지식을 개선하기 때문에 매년 발생하는 뎅그열 감염의 수백만을 줄이기 위해 방법을 포장에 이용하실 수 있습니다.

싸여 뎅그열 바이러스는 단일 가닥 RNA 긍정적인 게놈 5가 들어있는 nucleocapsid 껍질을 보호 90 봉투 당단백질 (E) dimers 구성된 외부 비계를 타고있다. 바이러스 표면에 동일한 단백질 subunits 따라서 아민 반응 염료로 분류하고 immunofluorescent 현미경을 통해 시각 수 있습니다. 여기, 우리는 알렉사 플루어 succinimidyl 에스테르 염색가 라벨 후 높은 가능한 바이러스를 굴복 나트륨 중탄산염 버퍼에 직접 용해와 뎅그열 바이러스의 라벨링의 간단한 방법을 제시한다. 라이브 바이러스 및 단백질 라벨은 보통 디메틸 sulfoxide의 색소의 reconstitution을 필요로 기존 제조 업체의 프로토콜의 라벨에 대한 표준화된 절차가 없습니다. 디메틸 sulfoxide의 존재, 심지어 분 수량에 바이러스의 생산 감염을 차단하고 또한 세포 세포 독성 6 유발 수 있습니다. 이 프로토콜의 디메틸 sulfoxide의 사용의 배제 따라서이 가능성을 감소. 알렉사 플루어의 염료가 우수한 photostability을 가지고 있으며 세포 이해와 바이러스의 endosomal 교통 연구에 이상적, 낮은 산도에 민감한 등 플루오레신와 rhodamine이 같은 일반적인 염료보다됩니다. 알렉사 플루어 염료의 활용은 바이러스 특정 항체 및 호스트 세포 7의 putative 수용체에 의해 표시 뎅그열 바이러스의 인식에 영향을주지 않았다. 이 방법은 virological 공부에 유용한 응용 프로그램을 수 있습니다.

Protocol

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1. 뎅그열 바이러스의 알렉사 플루어 라벨링

  1. 라벨 반응하기 전에, 자당 쿠션과 뎅그열 바이러스를 정화하고 같은 프로토콜에 표시된 필요한 시약과 장비를 준비합니다.
  2. 라벨 및 필터 주사기 0.2μm 필터를 소독 바로 앞에 신선한 0.2M 나트륨 중탄산염 버퍼, pH를 8.5 (라벨 버퍼) 및 히드록 실 아민 1.5M 버퍼, 산도 8.3을 (시약을 중지) 준비합니다.
  3. 2ml 튜브에 버퍼를 라벨링의 1ml에 뎅그열 바이러스를 정화 약 3x10 8 플라크 형성 단위 (pfu)를 희석. 이것은 바이러스의 일괄 라벨에 대한 비례까지 확장할 수 있습니다.
  4. Reconstitute 동결 건조된 알렉사 플루어 594 (AF594) 전에 라벨 반응 즉시 버퍼를 라벨에 1mM로 succinimidyl 에스테르. 알렉사 플루어 염료 시리즈에서 다른 fluorochromes 하나의 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 이 단계 이후 조명에 노출을 최소화합니다.
  5. 피펫 팁로 부드럽게 교반하면서 희석 바이러스에 1mM AF594 염료의 100μl를 추가합니다.
  6. 어둠 속에서 1 시간을 위해 실내 온도에서 상표 반응 믹스를 품어. 부드러운 뒤집어 모든 15mins로 섞는다.
  7. 테이블탑 ....

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Discussion

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AF594 염료가이 보고서에 사용했지만, 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르 시리즈 fluorophores 다양한 유사한 상표 화학 사용할 수 있습니다. 이 영상 이외 라벨 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다. 유동세포계측법는 흥분과 외과 기계가 감지할 수 fluorophores에 대한 상표의 정도를 계산하는 공촛점 현미경의 대안으로 사용할 수 있습니다.

알렉사 플루어의 염료는 무료 아미노 그룹, 주로 아르기닌과 리신 9 정상적으로 바깥쪽 단백질 잔류물을 마주와 반응 작은 분자 수 있습니다. 알렉사 플루어 594 염료의 100μM과 뎅그열 바이러스 우리의 실험실, 활용에서 바이러스 titer에서 최소한의 손실과 이미지에 대한 충분한 밝기를 제공했습니다. 다른 밝기는 사용 염료의 농도를 변화하여 얻을 수 있습니다. 그러나, 염료 농도를 증가하는 것은 바이러스 생존 7,10를 줄일 수 있습니다. 한 가지 제한 fluorophor.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
우리는 공개 없어요.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 의학 연구위원회, 싱가포르에 의해 재정 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 (옵션)
나트륨 중탄산염 시그마 - 알드리치 S6297
히드록 실 아민 시그마 - 알드리치 159417
수산화 나트륨 머크 106498
AF594 succinimidyl 에스테르 분자 프로브, Invitrogen A20004
PD - 10 컬럼 GE 헬스케어 17-0851-01
Hepes 시그마 - 알드리치 H6147
NaCl 시그마 - 알드리치 S3014
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 시그마 - 알드리치 E9884
M - 199 Invitrogen 11,150
FBS Hyclone SH30070.03
4 - 잘 플레이트 Nunc 176740
Coverslips Einst 0,111,520
현미경 슬라이드 브랜드 세일 7105
3H5 하이 브리 도마 ATCC HB46
10X PBS 첫번째 자료 BUF - 2040 - 10X1L
사포닌 시그마 - 알드리치 S4521
BSA 시그마 - 알드리치 A7906
마그네슘 염화물 시그마 - 알드리치 M2670
염화칼슘 시그마 - 알드리치 C3306
Paraformaldehye 시그마 - 알드리치 15,812-7
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Dabco 시그마 - 알드리치 D27802
테이블탑 원심 분리기 Eppendorf 5424
공촛점 현미경 자이스 혈구 LSM 710

M - 199 성장 매체를 준비하려면, 나트륨 pyruvate와 M - 199, 살균 필터의 500ml에 중요하지 않은 아미노산 5ml의 5ml, FBS의 50ml를 추가합니다.

M - 199 유지 보수 매체를 준비하려면, FBS의 15ml 나트륨 pyruvate와 M - 199, 살균 필터의 500ml에 중요하지 않은 아미노산 5ml의 5ml를 추가합니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
  2. Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield excep....

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Dengue Virus LabelingAlexa Fluor DyeImmunofluorescence AssaySize Exclusion ColumnPlaque AssayFluorescent MicroscopyVirus PurificationCellular UptakeEndosomal TransportColocalization Analysis

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