마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

초록

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 뇌에 재프로그래밍 인자 주입

1. 동물 설정, 정위 배치 및 드릴링 참고: 이 프로토콜은 NG2(뉴런-신경교 항원 2) 아교세포를 중간 뉴런으로 재프로그래밍하기 위해 Ascl1, Lmx1a 및 Nurr1(ALN)을 사용하는 데 중점을 둡니다. 우리의 경험에 따르면, 유사한 표현형의 중간 뉴런은 다른 요인 조합을 사용하여 얻을 수 있습니다
   정
   1. 위 프레임의 M/L-D/V 팔을 제자리(동물 위)로 이동하고 고정합니다.
      참고: 정위 프레임을 사용하면 전방/후방(A/P, Y 축), 내측/외측(M/L, X 축)을 따라 주사기를 조정할 수 있습니다. 및 등쪽/복부(D/V, Z축) 축.
   2. 정위 고정 프레임의 다른 축을 따라 주사기를 움직여 유리 모세혈관의 끝을 브레그마(서로 다른 두개골판이 만나는 접합점) 바로 위로 가져옵니다.
   3. 모세관 팁이 A/P 및 M/L 평면 모두에서 완벽하게 직선인지 확인하십시오. 모호한 브레그마의 경우 측면 봉합사와 정중선 봉합사의 평균을 취합니다.
   4. 모세관의 끝이 브레그마 위에 올바르게 배치되면 디지털 좌표 카운터에서 M/L 및 A/P 값을 모두 0.0으로 재설정합니다.
   5. 동물의 머리가 완벽하게 평평한 위치에 있는지 확인하려면 디지털 좌표 카운터를 사용하여 A/P 암이 +2.0 및 -2.0(M/L = 0.0)일 때와 M/L 암이 +2.0 및 -2.0(A/P = 0.0)일 때 D/V 좌표 값을 측정합니다. 그에 따라 치아 바와 이어 바의 높이를 조정하십시오.
   6. 선조체에 바이러스 벡터를 주입하기 위해 주사기를 원하는 좌표로 이동합니다(A/P = +1.0; M/L = -2.0, bregma에 관해).
   7. 주사기를 살짝 올리고 현미경으로 주사 부위를 보고 주사 좌표에서 치과용 드릴을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 원형으로 부드러운 방식으로 작업하면서 현장에서 드릴링을 시작합니다.
      참고: 드릴 비트는 추가 힘 없이 뼈를 통과할 수 있을 만큼 날카로워야 하므로 하향 압력을 너무 많이 가하지 마십시오. 열이 발생하므로 길고 지속적인 드릴링을 피하십시오.
   8. 드릴링이 끝나면 경막이 손상되지 않고 주입을 위해 노출되어 있는지 확인하십시오.
2. 주사기 설치 준비
   1. 열린 절개 부위에 면 거즈를 놓고 식염수로 주사기를 씻어냅니다.
   2. 세척 후 1-2 μL의 기포를 흡입한 다음 바이러스 벡터가 포함된 용액 1 μL를 흡수하여 의도하지 않은 기포를 피합니다. 주입하는 동안 기포 아래에서 바이러스 용액을 쉽게 시각화할 수 있는지 확인하십시오.
3. 바이러스 주입
   1. 절개 부위 위에서 면 거즈를 제거하고 정위 고정 프레임의 D/V 암을 사용하여 주사기를 내립니다. 두개골 표면에 접근하면 현미경을 주의 깊게 살펴보고 경막의 D/V 수준을 측정
   합니다.
   2. 모세관 끝으로 경막을 만지면서 D/V 좌표를 0.0으로 설정합니다.
   3. 주사기를 내리고 원하는 깊이(경막에 비해서는D/V = -2.7)까지 천천히 진행합니다. 바늘/모세혈관의 구부러짐이 관찰되지 않도록 궤적에 뼈 조각이 없는지 확인하십시오.
      참고: 제시된 좌표는 NG2-Cre 마우스의 선조체에 재프로그래밍 인자를 주입하는 것을 나타냅니다. 다른 뇌 영역에 해당하는 좌표를 사용할 수 있습니다. 새로운 마우스 계통의 뇌에 재프로그래밍 인자를 주입하기 전에 항상 염료(예: 트리판 블루), 컬러 비드 주사 또는 리포터 바이러스 벡터를 사용하여 먼저 주입 좌표를 테스트하십시오. 트리판 블루를 주사하는 경우 수술 직후 동물을 희생하고 뇌를 해부해야 합니다. 신선한 뇌는 동결된 상태에서 마이크로톰을 사용하여 절단할 수 있으며 뇌의 염료 위치를 시각화하여 주입 부위를 결정할 수 있습니다. 컬러 비즈를 사용하여 좌표를 테스트하면 주사 후 일주일 후에 관류 및 절단된 뇌의 주사 부위를 결정할 수 있습니다. 대안적으로, 리포터 유전자를 운반하는 바이러스 벡터를 주사하는 것을 사용할 수 있으며, 관류된 절단된 뇌에서 주사 부위를 결정할 수 있다.
   4. 0.4μL/min의 속도로 1μL의 바이러스 용액을 주입합니다. 전체 부피를 주입하면 주사기를 빼기 전에 2분의 확산 기간을 허용하십시오.
   5. 확산 후 모세혈관 끝이 뇌에서 완전히 빠져나올 때까지 주사기를 천천히 집어넣습니다.
   6. 상처 위에 면 거즈를 놓고 식염수로 주사기를 씻어냅니다.
   7. 정위 고정 프레임의 M/L-D/V 암을 작업 영역 밖으로 이동합니다.
4. 상처 봉합 및 수술 후 절차
   1. 봉합실을 사용하여 절개 부위를 조심스럽게 봉합합니다.
      참고: 주사된 동물에게 사용되는 모든 봉합사는 항바이러스 세제 용액이 들어 있는 컵/바이알에 폐기해야 합니다. 동일한 용액을 사용하여 수술 재료와 접촉한 수술 부위 주변의 모든 표면을 청소합니다. 모든 수술 도구는 각 수술일이 끝날 때 철저히 세척되고 고압멸균됩니다.
   2. 정위 프레임에서 동물을 제거하고 깨끗하고 가열된 케이지, 음식과 물에 대한 접근, 동물이 완전히 깨어날 때까지 머무르는 수술 후 스테이션에 배치합니다. 이 기간 동안 의식이 회복될 때까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오.
   3. 전자가 수술에서 완전히 회복될 때까지 수술을 받지 않은 동물과 함께 수술을 받은 동물을 수용하지 마십시오.
   4. 매일 수술을 받는 동물을 감독하십시오. 사용하는 봉합사에 따라 필요한 경우 제거해야 합니다. 모든 동물은 수술 후 관리로 Bupenorphinum(Temgesic at 1ml/kg)을 피하 투여했습니다.
      참고: 연속 2일 동안 동일한 주사기를 사용하여 수술하는 경우 물로 세척한 다음 에탄올 70%와 물을 다시 세척하십시오. 가능한 잔여물을 녹일 수 있도록 주사기에 물을 채운 채 밤새 두십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동물 모델
NG2-Cre 마우스	Jackson	NG2-CrexB6129, 재고 #008533
시약
물
식염수	Apoteket AB		70%
에탄올	Solveco
Isolfurane	Apoteket AB		따뜻한 물로 1% 용액으로 희석
Virkon	Viroderm	7511
Pentobarbital	Apoteket AB	P0500000	RSG의 60 mg/ml
자당	Merck	S0389-500G
Trypan Blu	Thermo Fisher Scientific 15250061
Retrobeads	Lumafluor	R170
Buprenorphine	Apoteket AB
장비			Solingen
가위	VWR	233-1552	생화학
핀셋	VWR	232-0007
겸자	VWR	232-0120
메스 홀더	VWR	RSGA106.621	번호 20
메스	VWR	RSGA106.200
정위 프레임	Stoelting Europe	51500D
마우스 이어 바	Stoelting Europe	51648	5 ul
주사기(탈착식 바늘 포함	Hamilton Company	65	0.75 내경 및 1.5 외경
유리 모세관	Stoelting	50811
유리 모세관 풀러	Sutter 회사	P-1000
치과용 드릴	Agnthos AB	1464
면도기	Agnthos AB	GT420
이소플루란 챔버 및 펌프	Agnthos AB		8323101 2mL
주사기	Merck	Z118400-30EA	25G
바늘	Merck	Z192414 Aldrich
위 프레임용 마우스 및 신생아 쥐 어댑터	Stoelting	51625
가열 패드	Braintree scientific, inc	53800M
면 거즈	Fisher Scientific	22-037-902
고무 튜브	Elfa Distrelec	HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150
면봉	피셔 사이언티픽	18-366-473

용량의 최종 절차용 ) . 정